Аптамеры короткие ribo-/deoxyribo-oligonucleotides выбран В пробирке Эволюции методов, основанных на сродством к конкретной цели. Аптамеры молекулярные инструменты признания с универсальным терапевтических, диагностических и исследовательских целях. Мы демонстрируем методы отбора аптамеров для амилоидных β-белок, возбудитель болезни Альцгеймера.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
Методическая статья
Выбор Аптамеры для β-амилоида белка, возбудитель болезни Альцгеймера
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Болезнь Альцгеймера (БА) представляет собой прогрессирующее возрастное нейродегенеративное заболевание с постепенным течением, что затрудняет его пресимптоматическую диагностику1. Окончательный диагноз БА ставится только посмертно, поэтому установление пресимптоматической ранней диагностики БА имеет решающее значение для разработки и применения эффективных методов терапии2,3.
Амилоид-β-белок (Aβ) играет центральную роль в патогенезе болезни Альцгеймера (БА). Считается, что растворимые олигомерные формы Aβ обуславливают нейротоксичность, лежащую в основе синаптической дисфункции и потери нейронов при БА4,5. Описаны различные формы растворимых агрегатов Aβ, однако их взаимосвязь и значение для этиологии и патогенеза БА сложны и изучены недостаточно6. Специализированные инструменты молекулярного распознавания могут помочь раскрыть взаимоотношения между агрегатами Aβ и облегчить их обнаружение и характеристику на ранних стадиях заболевания, до появления симптомов. Молекулярное распознавание обычно основано на использовании антител. Однако альтернативный класс инструментов молекулярного распознавания — аптамеры — обладает важными преимуществами по сравнению с антителами7,8. Аптамеры представляют собой олигонуклеотиды, созданные путем селекции in-vitro: систематической эволюции лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX)9,10. SELEX — это итерационный процесс, который, подобно дарвиновской эволюции, позволяет осуществлять отбор, амплификацию, обогащение и закрепление определенного свойства, например, высокоаффинного специфического связывания лиганда (аптамеры) или каталитической активности (рибозимы и ДНКзимы).
Несмотря на появление аптамеров как инструментов в современной биотехнологии и медицине11, они недостаточно использовались в области исследования амилоидов. Лишь немногие РНК- или одноцепочечные ДНК-аптамеры были отобраны против различных форм прионных белков (PrP)12-16. Было показано, что РНК-аптамер, созданный против рекомбинантного бычьего PrP, распознает бычий PrP-β17 — растворимый олигомерный конформационный вариант полноразмерного PrP, богатый β-слоями, который образует амилоидные фибриллы18. Было обнаружено, что аптамеры, созданные с использованием мономерного и нескольких форм фибриллярного β2-микроглобулина (β2m), связывают фибриллы некоторых других амилоидогенных белков, помимо фибрилл β2m19. Ylera et al. описали РНК-аптамеры, отобранные против иммобилизованного мономерного Aβ4020. Неожиданно эти аптамеры связали фибриллярный Aβ40. В совокупности эти данные поднимают несколько важных вопросов. Почему аптамеры, отобранные против мономерных белков, распознавали их полимерные формы? Можно ли получить аптамеры против мономерных и/или олигомерных форм амилоидогенных белков? Чтобы ответить на эти вопросы, мы попытались отобрать аптамеры к ковалентно стабилизированному олигомерному Aβ4021, полученному с помощью фотоиндуцированного сшивания немодифицированных белков (PICUP)22,23. Подобно предыдущим результатам17,19,20, эти аптамеры взаимодействовали с фибриллами Aβ и несколькими другими амилоидогенными белками, вероятно, распознавая потенциально общий структурный аптатоп амилоида21. В данной работе мы представляем методологию SELEX, использованную при создании этих аптамеров21.
Протокол
Часть 1: подготовка Белок и сшивания
Первоначально, белка, используемого для SELEX предварительно обрабатывается с 1,1,1,3,3,3-гексафтор-2-пропанол (HFIP), чтобы получить однородную, совокупный без подготовки, как описано выше 23. Этот шаг необходим, потому что предварительно сформированных агрегатов вызывают быстрое агрегации амилоидогенный белков, что приводит к плохой воспроизводимости экспериментальных 24, и нежелательны для выбора аптамеры для unaggregated, не фибриллярные формы белка.
- Взвесьте из ~ 800 мкг (~ 180 нмоль) чистой Aβ40 использованием микровесов. Передача сухого лиофилизированного пептида....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Отправной точкой процесса SELEX является синтез случайных библиотеки олигонуклеотидных обычно содержащих 10 12 -10 15 последовательностей. В ДНК SELEX, эта библиотека используется непосредственно после бассейна оцДНК создается, тогда как в РНК SELEX, продемонстрировали здесь, в библиотеке оцДНК преобразуется первый бассейн РНК путем ферментативно в пробирке транскрипции. Затем, SELEX выполняется итеративно при которой каждый цикл состоит из экспозиции и связывание олигонуклеотидов с заданн.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Нет конфликта интересов объявлены.
Благодарности
Эта работа была поддержана грантами AG030709 из NIH / НИА и 07-65798 от Калифорнийского департамента здравоохранения. Мы признаем, Маргарет М. Кондрон для синтеза пептидов и аминокислотного анализа, доктор Элизабет Ф. Нейфельд для оказания помощи и поддержки начальных этапов проекта, доктор Чи-Хун Б. Чена за оказание поддержки и реагентов, а также д-р Эндрю D . Эллингтона за полезные обсуждения.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Аβ40 | Лаборатория биополимеров Калифорнийского университета в Лос-Анджелесе (UCLA) | Лиофилизированный порошок | |
| Автоматизированная микровеса MX5 Automated-S | Mettler Toledo | ||
| Пробирки объемом 1,6 мл с силиконовым покрытием | Denville Scientific | C19033 или C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-гексафторпропан-2-ол (HFIP) | TCI America | H0424 | Использовать в вытяжном шкафу. |
| Персульфат аммония | Sigma-Aldrich | A-7460 | Перемешивайте на вортексе до полного растворения вещества. Раствор APS готовят непосредственно перед использованием; срок его годности составляет 48 ч. |
| Гексагидрат дихлоротрис(2,2'-бипиридил)рутения(II) | Sigma-Aldrich | 224758-1G | Перемешивайте на вортексе до полного растворения вещества. Оберните пробирку с RuBpy фольгой для защиты реагента от внешнего света. Раствор RuBpy готовят непосредственно перед использованием; срок его годности составляет 48 ч. |
| Дитиотреитол (ДТТ) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| D-соль™ Excellulose™ обессоливающие колонки | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| Ацетат аммония | Fisher Scientific | A637-500 | |
| Пробирки объемом 0,6 мл с силиконовым покрытием | Denville Scientific | C19063 | |
| Гели Novex Tricine (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-луночный; мини-размер (8 см X 8 см); 25 μобъем нанесения на лунку; диапазон разделения от 5 кДа до 40 кДа |
| Кварцевая кювета | Hellma | 105.250-QS | |
| Спектрофотометр Beckman DU 640 | Beckman Coulter Inc. | ||
| библиотека одноцепочечной ДНК | Integrated DNA Technologies | Изготовленный по индивидуальному заказу | Библиотека была разработана таким образом, чтобы содержать 49 случайных нуклеотидов, фланкированных двумя константными областями, содержащими сайты связывания праймеров и сайты клонирования: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 5'-G TCC GTT CGG GAT CCT-3'’ |
| Taq-ДНК-полимераза | USB Corp., Affymetrix | 71160 | Рекомбинантный <электронная микроскопия>Thermus aquaticus ДНК-полимераза, поставляемая в количестве 10× ПЦР-буфер и отдельная пробирка с 25 мМ MgCl22 для рутинной ПЦР. |
| Смесь нуклеотидов для ПЦР, раствор 10 мМ | USB Corp., Affymetrix | 77212 | (по 10 мМ dATP, dCTP, dGTP, dTTP) |
| Прямой праймер | Integrated DNA Technologies | Изготовленный по индивидуальному заказу | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| Обратный праймер | Integrated DNA Technologies | Изготовленный по индивидуальному заказу | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| Амплификатор (термоциклер) | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| Набор QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| Агароза | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| Стерильные конические пробирки объемом 1,6 мл с прикрепленными крышками и уплотнительными кольцами | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ Система крупномасштабного производства РНК–T7 | Promega Corp. | P1300 | В набор входит: 120 μСмесь ферментов (РНК-полимераза, рекомбинантный RNasin)® ингибитор рибонуклеазы и рекомбинантная неорганическая пирофосфатаза); 240 μ5х буфер для транскрипции; 100 μкаждый из 4 рНТФ, 100 мМ; 110 ед. RQ1 DNase, очищенной от РНаз, 1 ед./μl; 10 μлинейный контрольный ДНК, 1 мг/мл; 1 мл 3М ацетата натрия (pH 5,2); 1,25 мл воды, свободной от нуклеаз |
| α-32P-цитидин 5’-трифосфат, 250 μСi (9,25 МБк), | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | Удельная активность: 3000 Ки (111 ТБк)/ммоль, 50 мМ трицин (pH 7,6) |
| Фенол:хлороформ:изоамиловый спирт, насыщенный цитратом (125:24:1, pH 4,7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| Хлороформ:изоамиловый спирт (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| Абсолютный этанол для молекулярной биологии | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| охлаждаемая микроцентрифуга Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ Микроколонки G-50 | GE Healthcare | Приобретено в компании Fisher Scientific (45-001-487) | Предварительно заполнен Sephadex™ G-50 (сорт для ДНК), предварительно уравновешенный в буфере STE, содержащем 0,15% Kathon в качестве биоцида |
| Настольный сцинтилляционный счетчик Triathler | Hidex Oy, Турку, Финляндия | Модель Triathler LSC: 425-034 | |
| Novex® Буфер для образцов TBE-мочевина (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| 6% ТВЕ-мочевинные гели 1,0 мм, 10 лунок | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® Электрофоретический буфер TBE (5X)×) | Invitrogen | LC6675 | |
| Средство для дезактивации радиоактивного загрязнения | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| Наконечники для нанесения проб на гель | Denville Scientific | P3080 | |
| XCell <электронная микроскопия>SureLock Мини-клетка | Invitrogen | EI0001 | XCell <ЭМ (электронная микроскопия)>SureLock Мини-клетка |
| Авторадиографическая пленка | Denville Scientific | E3018 | Использовать в полной темноте |
| Авторадиографическая пленка Hyperfilm™ ЭХЛ | Amersham | RPN3114K | Можно использовать при красном безопасном свете. |
| Мембранные диски | EMD Millipore | GSWP02500 | смешанный эфир целлюлозы, гидрофильный, 0,22-μмембраны m-disc |
| Стеклянный фильтрующий диск (основание) для колбы объемом 125 мл | VWR international | 26316-696 | |
| Чашки Петри | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Мочевина | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| ЭДТА | Fisher Scientific | 118430010 | |
| Гликоген | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-пропанол для молекулярной биологии | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| Рекомбинантный ингибитор РНказы | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™Система обратной транскрипции | Promega Corp. | A3802 | |
| Рекомбинантный ингибитор РНказы | USB Corp., Affymetrix | 71571 | |
| RapidRun™ Краситель для нанесения образцов | USB Corp., Affymetrix | 77524 |
Ссылки
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
