Первичные культуры нейронов из мозга дрозофилы поздней стадии куколки

Краткое содержание

Это видео демонстрирует подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Просмотров живых культур показывают результат аксонов и отображения уровня кальция использованием Фура-2.

Аннотация

В этом видео, мы демонстрируем подготовки первичных нейронов культур из мозга дрозофилы поздней стадии куколки. Процедура начинается с удаления из мозга животных на 70-78 часов после пупария образования. Изолированные мозги показываются после краткой инкубации в папаин последовало несколько моет в бессывороточной ростовой среды. Процесс механической диссоциации каждой мозга в 5 мкл капли СМИ на покровное иллюстрируется. Аксонов и дендритов после митотического нейроны sheered с рядом сома в период раздробленности, но нейроны начинают восстанавливать процессы в течение нескольких часов обшивки. Изображения показывают живые культуры на 2 дня. Нейроны продолжить разработку процессов в течение первой недели в культуре. Конкретные нейронные популяции могут быть идентифицированы в культуре использованием GAL4 линии ездить ткани конкретное выражение флуоресцентные маркеры, такие как GFP и RFP. Всего записей ячейки продемонстрировали культурные нейроны формируют функциональные, спонтанно активных холинергической и ГАМК-синапсы. Короткий сегмент видео иллюстрирует динамику кальция в нейроны культурный использованием Фура-2 в качестве красителя показатель кальция для контроля спонтанной переходных кальция и никотина вызвала ответы кальция в блюдо культурный нейронов. Эти куколки культур мозга полезной модели системы, в которой генетические и фармакологические средства могут быть использованы для определения внутренних и внешних факторов, которые влияют на формирование и функции центральных синапсов.

Протокол

Подготовка до дня культивирования:

1. Сделать стерильной рассекает решение.
2. Сделать стерильной DMEM и храните в 10 мл аликвот при 4 ° С в течение 2 недель.
3. Сделать стерильной DDM2 добавки и заморозить в 50 или 100 мкл аликвоты в течение 1 месяца.
4. Сделать ConA / ламинин.
5. Пальто покровные.
   Дополнительно: Сделать стерильной CNBM и хранить замороженными до 4 месяцев.

В день культивирования

I. Подготовка раствора фермента (ES) в ламинарном потоке капот

1. Положите 5 мл рассекает решение (DS) в 15 мл центрифужную пробирку.
2. Взвесить 0,8 мг L-цистеин в 0,6 мл Eppendorf и добавить 150 мкл DS. Внесите вверх и вниз, пока кристаллы не ушли.
3. Добавить 150 мл DS / цистеина в 5 мл DS и хорошо перемешать.
4. Добавить 50 U (единиц) папаин.
5. Добавить 7 мл 0,1 N Na ОН и хорошо перемешать. Решение будет ясно в течение 30 мин. при активации.
6. Фильтры решение фермента с 0,2 мм шприц фильтр в стерильный 1,5 мл винт трубки микроцентрифужную крышкой
   
   Папаин: Хотите 50 ЕД в 5 мл DS. Каждая партия несколько отличается, поэтому необходимо рассчитать, сколько:
   37,3 мг / мл и 28,3 ед / мг
   37,3 х 28,3 = 1055,59 ед / мл (1000 мл)
   50 U = 47,4 мл
   

II. Сделать DDM2 СМИ

В день культивирования: добавить следующие дополнения, чтобы сделать DDM2

К 10 мл DMEM добавить добавки, как раз перед культивирования:

1. 100 мкл трансферрина
2. 100 мкл путресцин
3. 100 мкл Селен
4. 100 мкл Прогестерон
5. 50 мкл инсулина
6. 10 мкл 20-гидроксиэкдизона

Примечание: достаточно DDM2 для всех культур запланированных (каждый мозга высевали на одном покровное в отдельных 35 мм блюдо Петри, 1,5 мс СМИ / культура)

Шаг III-VI может быть сделано нестерильных скамейке лаборатории и должен быть завершен в течение 45 минут или меньше.

III. Куколки коллекции

1. Выберите 10-15 куколки из сторон флакон под рассекает микроскопом.
2. Место куколки в крышке сухой 35 мм блюдо Петри.

Примечание: Мы обычно используем мозг из куколок между 55-78 часов после пупария образования (НПФ). Это немного труднее вскрыть из мозга от младшего куколки с головой капсулы имеют тенденцию к краху, в то время как общий уровень аксонов несколько ниже из старейших куколок. В Canton-S штамм дикого типа, эти этапы признаны пигментированные глаза, светло-коричневые или слегка красноватый, с небольшим пигмента в другом месте.

IV. Обезглавливание при вскрытии микроскопом

1. Место две капли стерильного рассекает решение в крышку чашки Петри, рядом с куколками.
2. Аккуратно прижмите одну куколку с тонкими щипцами в левой руке и использовать 27 калибр иглы шприца прилагается к 1 мл шприц в правую руку, чтобы удалить кутикулу на переднем конце тела куколки.
3. Сожмите куколки слегка щипцами и головой, как возникает использовать 27 иглы разорвать шею.
4. С кончика иглы или пинцета, передача головы до капли рассекает решение.
5. Повторяйте, пока у вас есть 10-15 голов в одной капли.

В. Удаление мозг от головы под микроскопом рассекает

1. В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27.
2. Используйте их, чтобы положение лететь головой в капле рассекает решения, чтобы хоботок стоит перед вами и спинной поверхности головы на север.
3. Вставьте левую иглу в хоботок, чтобы прикрепить голову вниз и правой иглы, чтобы сделать щель в правый глаз, который идет от брюшной части спинной поверхности.
4. Вставьте правую иглу рядом с левой в области хоботка, а затем использовать левую спицу, чтобы мягко подавляют кутикулы над левым глазом, подталкивая мозг к щели в правый глаз. Мозг должен выйти из щели на правом, относительно нетронутыми, часто с обеих оптических сеБес еще привязаны, а иногда пигментированные ткани глаза, а также.
5. Нажмите мозга на спину иглу и трансфер в каплю стерильного физиологического раствора в рассекает новые стерильные, 35 мм блюдо Петри.
6. Сбор 10-15 мозг для каждого генотипа.
   

VI. Удаление оптических долях и обработки ферментом

1. В каждой руке держать 1 мл шприц с иглой 27 и использовать их, чтобы собрать все мозги в одном небольшом участке капли рассекает решение
2. Использование шприцев в качестве режущего инструмента для удаления зрительных долях мозга от каждого так ткани оставшихся для культуры центральной области мозга.
3. Используйте 20 мкл pipetman, заход в 5 мкл, чтобы передать все мозги одного генотипа к трубке Эппендорф, содержащий 1 мл стерильного раствора папаин.
4. Мозги инкубировали в папаин в течение 10-15 минут на ротатор установлен на уровне 60 оборотов в минуту.
5. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
   

Внутри стерильной ламинарном боксе - все шаги, где ткань подвергается воздействию воздуха должно быть сделано в ламинарный поток капот для оставшихся шагов.

VII. Мытье

1. Удалить ферментный раствор и заменить стерильными рассекает решение.
2. Центрифуга при 3000 оборотов в минуту в течение 3 минут.
3. Промыть стерильной рассекает решение общей сложности 3 раза.
4. Удалить рассекает засоленных и заменить DDM2.
5. Центрифуга и мыть всего 2 раза с DDM2.
6. Передача мозги и СМИ, чтобы стерильные 35 мм блюдо Петри.
   

VIII. Растирание и покрытие под микроскопом рассекает

1. Место 5 мкл DDM2 в центре покровное.
2. Передача 1 мозгу эту каплю DDM2 с желтым кончиком.
3. Под микроскопом, использовать 27 игл колеи на кости до мозга на мелкие кусочки (если взять <1 минуты).
4. Под визуальным руководством, сломать кончик стеклянной пипетки, которая тянется к тонкий момент, так что большие куски можно осторожно засасывается в кончике пипетки и выслан обратно в среду. Мы используем рот всасывания труб, которые поставляются с 100 мкл гематокрита капиллярное стекла.
   
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не получить пузырьков в средствах массовой информации и вам необходимо эмпирически определить оптимальный размер пипетки в использовании. Хорошие позволяют отделить мозг с отдельных клеток и еще некоторые крупные комки, приблизительно через 30 секунд / мозга. Когда вы смотрите на эти при более высокой мощности, примерно 10-20% нейронов должна все еще есть некоторые процессы оставшихся и еще будет несколько больших комков. Если вы диссоциируют слишком много, то все клетки будут круглые и они будут иметь устойчивый так много вреда они не выживут. Этот шаг требует практики и должно быть сделано быстро, так как существует большое отношение поверхности к объему и осмотического давления и рН капли DDM2 может быстро измениться. Ткань должна быть помещена в CO ₂ инкубаторе как можно быстрее.
   
   
5. Напишите на крышке чашки Петри: «Генотип, дата и время".
6. Положите 35 мм чашки Петри в 100 мм блюдо Петри (с мокрой kimwipe), а поселиться в CO ₂ инкубаторе в течение 30 мин.
7. Потоп 35 мм блюдо с 1,5 мл DDM2.
8. Держите культур в инкубаторе при 5% СО ₂ инкубатора (23 ° С).
   
   Примечание: Если у вас нет доступа к охлаждению CO ₂ инкубатора, использование стандартных тканей млекопитающих культуры инкубатор и либо поместить его в прохладном помещении и нагреть до 23 ° C, или положить в лаборатории, выключите темп, и использовать льда в лоток в нижней части инкубатора регулировать темп вокруг окружающей среды.
   

IX. Кормление Клетки

1. На День 1 (следующий день), добавить 0,5 мл CNBM/B27 (условные СМИ), чтобы сделать 3:01 DDM2: CNBM/B27.
2. На 5-й день заменить 1 мл среды для 3:01 DDM2: CNBM/B27.
3. Продолжайте кормление клеток с 3:01 DDM2: CNBM/B27 каждые 4-5 дней.
   
   Примечание: культур можно выращивать без не-нейронных кондиционированной среде, но нейроны появляются чуть более хрупкими и более трудны для использования в экспериментах электрофизиологии.

Обсуждение

Нейроны найденным на мозг эмбриональных / послеродовой грызуны могут быть выращены в первичной культуре клеток, где они распространяются невриты и форма функциональной синаптических связей. Методы подготовки этих культур, хорошо известны и учится в грызунах нейронных культур сыграли решающую роль в идентификации генов и экологических факторов, участвующих в регуляции формирование синапса и функция (банкир и Гослин, 1991). Хотя насекомых нейронов из различных видов также может быть выращен в культуре, только нейроны насекомых показано, форми...

Материалы

Покрытие Покровные: Положите автоклавного покровных в 60 мм чашке Петри. Внесите 5 мкл Con / Ламинин смеси на центр каждого покровное. Место в 37 С инкубаторе в течение 2 часов. Промыть 3x покровные с 100 мкл из автоклавного воды каждый. Использование вакуумных прилагается к стерильной пипетки Пастера. Во время последнего полоскания, забрать покровное щипцами и сухой обеих сторон. Передача покровное к блюду 35мм Петри. Хранить при комнатной температуре на срок до месяца.