$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из статьи Сарасии и Нормана, Измерение скорости потребления кислорода в Intact Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2019).
1. Рост и синхронизация популяции нематод
Эти животные достигнут личиночной стадии L4 через ~42 часа. В это время переместите личинки L4 с помощью платинового медиатора в засеянные NGM-планшеты OP50, содержащие 0,5 мг/мл 5-фтор-2'-дезоксиуридина (FUdR), чтобы предотвратить их производство потомства.
ПРИМЕЧАНИЕ Убедитесь, что в рамках эксперимента все штаммы синхронизированы в течение одинакового периода времени. Обработка FUdR стерилизует животных и предотвращает яйцекладку и производство потомства, что может повлиять на OCR. Эти стерилизованные животные будут проанализированы на следующий день (1-й день взрослых животных в ~66 ч) для проведения анализа. Сообщалось, что FUdR влияет на физиологию и продолжительность жизни некоторых мутантных червей. Поэтому это следует учитывать при использовании препарата для стерилизации. Черви также могут быть стерилизованы с помощью феминизирующих мутаций, таких как fem-1(hc17) или fem-3(e2006). Тем не менее, эти мутации могут повлиять на функцию митохондрий.
- Перенесите личинки L4 желаемого генетического фона (например, N2 [дикий тип] и животные sel-12) на пластины с нематодами для роста (NGM) (рецепт см. в Таблице 1), только что засеянные газоном Escherichia coli (OP50). Используйте не менее двух пластин 100 мм или трех пластин 60 мм для каждого штамма. Инкубируйте червей при соответствующей температуре роста (от 15 до 25 °C) в течение 3–4 дней или до тех пор, пока пластины не сконцентрируются с большим количеством яиц и подливных червей.
- Смойте яйца и червей с планшетов, используя примерно 6 мл буфера M9 (рецепт см. в Таблице 1) на 100-миллиметровую пластину нематод и переложите их стеклянными пипетками Пастера в отдельные центрифужные пробирки объемом 15 мл для каждого штамма. Вращайте эти трубки в течение 3 минут при температуре 6 180 x g и отсасывайте буфер M9, оставляя только животных и гранулы яиц.
- Добавьте 3–4 мл раствора отбеливателя (см. рецепт в Таблице 1) в каждую пробирку и периодически переворачивайте в течение 6 мин. Добавьте буфер M9, чтобы заполнить каждую пробирку, и вращайте при 6 180 x g в течение 1 мин и аспирируйте надосадочную жидкость. Повторите эту промывку с M9 три раза и переместите яичную гранулу в свежую пробирку объемом 15 мл, содержащую примерно 9 мл буфера M9.
- Только что вылупившихся червей синхронизируйте с помощью нагрева при температуре 20 °C в течение 16–48 ч. Вращайте эти трубки при температуре 6 180 x g в течение 1,5 мин и помещайте синхронизированных животных L1 на отдельные пластины NGM, только что засеянные газоном OP50 (примерно 6 000–10 000 животных на 100 мм пластину) и поддерживайте при температуре 20 °C.