Удаление куколок у насекомых: метод исследования куколок

Аннотация

Источник: Fukutomi, Y., et al. Методы определения стадии куколочных периодов и измерения пигментации крыльев Drosophila guttifera.J. Vis. Exp. (2018).

В этой статье описывается метод удаления куколки насекомого, сохраняя при этом внутреннюю куколку нетронутой и, следовательно, пригодной для дальнейшего исследования. В примере протокола показана процедура с Drosophila guttifera; однако этот метод применим и к другим видам дрозофил.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Fukutomi et al., Methods for Staging Pupal Period and Measurement of Wing Pigmentation of Drosophila guttifera, J. Vis. Exp. (2018).

1. Удаление пупария

ПРИМЕЧАНИЕ Куколки дрозофилы покрыты структурой, называемой пупарием. Насекомое Muscomorpha (мухи) не сбрасывает личиночную кутикулу при окукливании; Вместо этого он затвердевает кутикулу после аполиза и использует ее в качестве защитного покрова для куколки, пупария. У куколки, живущей внутри пупария, есть настоящая кукуколка, которая очень мягкая и хрупкая. Перед тем, как происходит аполиз вокруг P4(ii), эпителий и пупарий прикрепляются друг к другу, и поэтому удалить пупарий без повреждений очень сложно. После P5 удаление пупария трудоемко, но полезно для морфологического наблюдения и определения стадий куколки. Процесс осуществляется следующим образом.

1. Прикрепите кусок двустороннего скотча к листу бумажного полотенца.
2. Поместите куколку на двусторонний скотч брюшной стороной вверх (рисунок 1А).
3. Найдите пространство между передней стороной пупария и внутренней куколкой. Захватите и удалите пупарий вокруг этой щели с помощью щипцов, а также обнажите переднюю сторону головки куколки.
4. Введите кончик щипца, переместив его параллельно передне-задней оси. Поднимите кончик щипцов, чтобы локально сломать пупарий. Повторяйте это действие до тех пор, пока поломка не достигнет задней части пупария. Убедитесь, что между пупарием и ногами куколки также образовался зазор, а также сломайте вентральную сторону куколки и минимизируйте повреждение внутренней куколки (рисунок 1B).
5. Разбив пупарий как можно сильнее, выньте куколку с помощью тонкой кисти (#5/0) (Рисунок 1C).
6. Поместите куколку на лист папиросной бумаги, смоченный ddH₂O и поместите в пластиковую чашку Петри (диаметр 60 мм x высота 15 мм). Делайте фотографии как можно скорее, потому что экспонированная куколка уязвима и легко становится сухой.
    

Результаты

Рисунок 1. Иллюстрация удаления пупария.(A) Поместите куколку брюшной стороной вверх на кусок двустороннего скотча. Удалите переднюю часть пупария. (Б) Сломайте пупарий щипцами с вентральной стороны. (В) После разламывания пупария выньте куколку с помощью кисти.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Дрозофила гуттифера (Drosophila guttifera)	Центр популяции видов дрозофил в Калифорнийском университете в Сан-Диего	15130-1971.10	Drosophila guttifera — вид плодовых мух, используемый в этой статье
Двухсторонний скотч NICETACK	Нитибан	СЗ-15СФ	Двусторонний скотч, для удаления пупария
Щипцы Dumont #5	Инструменты для точной науки	11252-20	Щипцы, для удаления пупария
Ван Гог VISUAL Кисть для рисования	Таленс Япония	GWVR-#5/0	Кисть малярная, для удаления пупария
Стереомикроскоп	Олимп	СЗХ16	Стереомикроскоп, для морфологических наблюдений
Цифровой фотоаппарат	Олимп	DSE-330-A	Цифровая камера, для обработки изображений
Стандартная чашка для культивирования тканей Falcon	Корнинг	353002	Пластиковая чашка Петри (диаметр 60 мм x высота 15 мм)