$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Koemans et al., Drosophila Courtship Conditioning As a Measure of Learning and Memory, J. Vis. Exp. (2017).
ПРИМЕЧАНИЕ: В протоколе, описанном ниже, описана одна реплика сбора, обучения и тестирования. Чтобы проверить воспроизводимость результатов, эти шаги следует повторять параллельно, в течение нескольких дней и с отдельными группами мух (табл. 1). Протокол основан на 10-дневном жизненном цикле от яйца до взрослой особи, что является нормальным при выращивании мух в постоянных условиях 25 °C, 70% влажности и 12-часовом цикле свет/темнота. Все аспекты этого протокола предполагают, что условия поддерживаются постоянными на протяжении всего анализа. Время указывается как часы до включения света (BLO) или после включения света (ALO) в инкубаторе, так как это время можно удобно установить в зависимости от предпочитаемого исследователя времени суток. Используйте газ CO2 только для первоначального сбора наивных самцов мух и для сбора предварительно спаренных самок. Этот протокол для обусловливания ухаживания состоит из следующих этапов:
- Создание коллекционных культур для женских особей
- Создание культур для сбора подопытных мужского пола
- Подготовка жилых блоков
- Создание брачных флаконов для производства стандартизированных предварительно спаренных самок
- Коллекция подопытных мужского пола
- тренировка
- тестирование
- Анализ видеоданных и статистика
1. Создание коллекционных культур для женских
пород
- Приготовьте powerfood. Отварить 0,8% (w/v) агара, 8% (w/v) дрожжей, 2% (w/v) дрожжевого экстракта, 2% (w/v) пептон, 3% (w/v) сахарозы, 6% (w/v) глюкозы, 0,05% (w/v) MgSO4 и 0,05% (w/v) CaCl2 в воде в течение 15 минут. Дайте раствору остыть до 70 °C перед добавлением 0,05% (по массе) метилпарабена (ОСТОРОЖНО: токсично) и 0,5% (по объему) пропионовой кислоты (ОСТОРОЖНО: токсично). Хорошо перемешайте, помешивая и охлаждая до 50 °C, чтобы получить однородный раствор.
- Прежде чем пища затвердеет при комнатной температуре, добавьте ~50 мл powerfood в каждый пластиковый флакон объемом 175 мл. Дайте пище остыть. Закройте флакон заглушкой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Powerfood — это специализированная пищевая смесь, разработанная специально для разведения большого количества мух, предположительно путем стимуляции откладывания яиц. Powerfood не используется для производства самцов мух, которые будут использоваться для анализа поведения (шаг 2), потому что нетипичная диета и потенциальная скученность могут повлиять на развитие.
- На 11-й день (Таблица 1) начните выращивать 5-20 диких культур с примерно 60-100 мухами (самцами и самками) во флаконах с пищей; они будут использоваться на шаге 4 для получения стандартизированных предварительно спаренных самок. Добавьте фильтровальную бумагу в каждый флакон, чтобы увеличить площадь, на которой личинки могут окукливаться; Это увеличит количество мух, которые могут сомкнуться.
- Периодически повторяйте шаги 1.1-1.3 на протяжении всего эксперимента, чтобы получить достаточное количество новых мух в качестве исходных данных для «создания брачных флаконов для производства стандартизированных предварительно спаренных самок» (шаг 4).
2. Создание культур для коллекции подопытных мужского пола
- Приготовьте обычную пищу, состоящую из 0,5% (масса/об.) агара, 2,75% (масса/об.) дрожжей, 5,2% (масс/об.) кукурузной муки, 11% (масс/об.) сахара, 0,05% (масс/об.) метилпарабена и 0,5% (v/v) пропионовой кислоты в воде, как описано в шагах 1.1 и 1.2. Закройте пластиковые флаконы объемом 175 мл пробкой для флаконов.
- На 10-й день (Таблица 1) поместите около 10-20 самцов и примерно 30-75 девственных самок (Таблица материалов/оборудования) в каждый флакон объемом 175 мл с обычной пищей. Добавьте фильтровальную бумагу, чтобы увеличить площадь поверхности для окукливания и максимизировать производительность.
- Установите от трех до шести флаконов объемом 175 мл на каждый генотип, чтобы получить необходимое количество самцов испытуемых.
ПРИМЕЧАНИЕ: Может потребоваться больше флаконов, в зависимости от продуктивности желаемого генотипа.
3. Подготовка жилых блоков (Рисунок 2A)
- Растопите примерно 50 мл powerfood на каждый блок в микроволновой печи или приготовьте его свежим.
- Добавьте 500 μL powerfood в каждую лунку 96-луночного блока с плоским дном с помощью дозатора с помощью дозатора.
- Дайте пище застыть при комнатной температуре.
- Накройте блоки клейкой пленкой для ПЦР и с помощью иглы сделайте не менее 4 отверстий в лунке, чтобы обеспечить приток свежего воздуха для мух.
- Чтобы иметь возможность открыть каждую лунку, используйте лезвие бритвы, чтобы разрезать клейкую пленку вдоль между каждым рядом. Оставьте пленку нетронутой на одном конце блока.
- Блоки могут храниться при температуре 4 °C до 2 дней.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед использованием дайте блокам восстановиться до комнатной температуры.
4. Создание брачных флаконов для производства стандартизированных предварительно спаренных самок
- В день -1 удалите и выбросьте всех взрослых мух дикого типа из предварительно спаренных самок коллекционных культур в течение 2-5 часов BLO.
- Соберите мух с помощью аспиратора (Рисунок 2B) из этих флаконов с интервалом от 2 до 3 часов (например, через 30 минут, 2,5 часа и 5 часов ALO) и поместите их в новую пробирку Powerfood, дополненную небольшим количеством дрожжевой пасты и фильтровальной бумаги.
- Чтобы избежать скопления людей и создать оптимальную атмосферу для спаривания, не перекладывайте более 150-200 мух в каждую новую пробирку. Обеспечить спаривание всех самок, обеспечив не менее 25% самцов. Убедитесь, что в брачных флаконах присутствует достаточное количество самок, чтобы приспособиться к размеру эксперимента.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку это важный шаг в протоколе, убедитесь, что в новую брачную пробирку переносятся только свежезакрытые мухи и никакие старые мухи, личинки или куколки.
- Инкубируйте эти «брачные флаконы» в течение четырех дней, чтобы дать достаточно времени для спаривания всех самок.
5. Коллекция подопытных мужского
пола
- В день 1 (Таблица 1) в 2-3 часа BLO используйте CO2 для удаления всех взрослых мух из флаконов для сбора самцов (шаг 2), но дайте большему количеству мух приблизиться в течение следующих нескольких часов.
- В течение следующих 5-6 часов удаляйте только что закрытых мушек каждые 20-30 минут с помощью CO2 и помещайте каждого самца в отдельную лунку жилого блока (шаг 3) с помощью аспиратора (Рисунок 2B).
- Повторно загерметизируйте лунку клейкой пленкой для ПЦР.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это важнейший шаг в протоколе. Самцов следует собирать часто. Собранных самцов следует изолировать в жилом блоке ближе к моменту выведения, когда у них проявляется бледная пигментация и наличие мекония в полупрозрачном брюшке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Бережное использование аспиратора позволяет осуществлять перенос мух; однако неправильное использование приведет к стрессу для мух, что приведет к отклонениям в анализе (см. Обсуждение).
- Стремитесь собрать до 48 самцов на каждый генотип. Это обеспечивает небольшое превышение максимального числа самцов, необходимого для анализа как наивных, так и обученных условий, что позволяет привести к некоторым потерям на последующих этапах переноса.
6. Обучение
- Удалите мух из брачного флакона (шаг 4.2) с помощью CO2 и отделите предварительно спаренных самок от самцов.
- Используя аспиратор, добавьте по одной анестезиологической, предварительно спаренной самке в каждую лунку в одном ряду нового жилого блока.
- С помощью аспиратора и без анестезии перенесите отдельного наивного самца из жилого блока, созданного на шаге 5.2, в колодец, содержащий предварительно спаренную самку. После того, как самец будет помещен в лунку, немедленно повторно запечатайте клеевой пленкой; Не позволяйте самцу убежать.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перенесите самцов мух из аспиратора в жилой блок, воспользовавшись их естественным поведением «негативного геотаксиса».
- Повторяйте шаги 6.2-6.3 до тех пор, пока не образуется достаточное количество пар самец-самка. В идеале установите 24 пары, два полных ряда жилого блока, для каждого генотипа. Оставьте оставшихся наивных мужчин в исходном жилом блоке, созданном на шаге 5.2.
- Не беспокойте пары самец-самка в течение периода обучения (Таблица 2, Рисунок 1B).
ПРИМЕЧАНИЕ: В течение этого времени самец будет ухаживать и быть отвергнутым самкой. Для обучения и СТМ период обучения составляет 1 час, а для НТМ период обучения составляет 7-9 часов.
- Завершите тренировку (Таблица 2, Рисунок 1B) с помощью аспиратора аккуратно отделите самца от предварительно спаренной самки; не используйте анестезию. Поместите отделенного самца в новый жилой блок.
- С помощью аспиратора аккуратно и без анестезии перенесите всех наивных мужчин из жилого блока, созданного на шаге 5.2, в новый жилой блок><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необязателен для STM и обучения, но он очень важен для LTM, потому что мухи размещаются еще на 24 часа для тестирования LTM.
- Для STM и LTM дайте самцам отдохнуть в течение 1 ч и ~24 ч соответственно (Таблица 2, Рисунок 1B) перед испытанием (шаг 7).
- Для обучения немедленно протестируйте обученных и наивных самцов (шаг 7).
7. Тестирование
- Соберите мух из брачных флаконов (шаг 4.2) с помощью CO2 и отделите предварительно спаренных самок от самцов.
- Дайте самкам восстановиться после анестезии в течение не менее 1 часа во флаконе, содержащем обычную пищу.
- Заранее смонтируйте видеорегистраторы (Рисунок 2C), чтобы все оборудование было готово до начала тестирования.
- Начните тестирование в соответствии с различными временными шкалами для обучения, STM и LTM (Таблица 2, Рисунок 1B). Проводите тестирование сразу после подготовки к обучению, через 1 час после тренировки для STM и через 24 часа после тренировки для LTM.
- С помощью аспиратора осторожно переместите отдельного самца из блока отдыхающего жилья или из блока тренировочного жилья, если проверяется обучение (шаг 6.7, обученный; шаг 6.8, наивный) на одну половину арены ухаживания с закрытой перегородкой (Рисунок 2D; см. план здания в файле S1).
ПРИМЕЧАНИЕ: Использование естественного поведения «негативного геотаксиса» должно быть достаточным для перевода самцов мух из аспиратора в арену ухаживания.
- Быстро, но аккуратно переместите входное отверстие на следующую арену и повторяйте шаг 7.5, пока на всех 18 аренах не появится по одному самцу.
- Используя аспиратор и не имея CO2, добавьте одну предварительно спаренную самку (собранную на шаге 7.2) к другой половине всех 18 арен.
- Осторожно поместите камеру ухаживания под камеру, отверстие лунок направлено вниз (Рисунок 2C).
- Снимите разделитель арен, чтобы обеспечить прямое взаимодействие между самцами и спаренными самками.
- Немедленно начните записывать поведение в течение как минимум 10 мин.<бр/>
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании конфигурации с двумя камерами параллельная запись двух пластин ухаживания может быть выполнена в перекрывающихся временных интервалах для достижения максимальной эффективности.
- Опорожните брачные арены с помощью ручного пылесоса и дайте камере ухаживания проветриться перед повторным использованием.
- Повторяйте шаги 7.4-7.11 до тех пор, пока не будет завершено тестирование всех генотипов и состояний (т.е. наивных и обученных).
8. Анализ видеоданных и статистика
- Рассчитайте индекс ухаживания (ДИ), определяемый как процент времени, в течение которого самец ухаживает за мной в течение первых 10 минут тестового периода, для каждого отдельного самца><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это можно сделать вручную, наблюдая за стереотипным поведением ухаживания (Рисунок 1A) или используя компьютерное программное обеспечение для автоматической количественной оценки поведения ухаживания.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется анализировать 40-60 самцов по каждому состоянию в течение трех дней, чтобы достичь достаточной статистической мощности и судить о согласованности данных ДИ.
- Рассчитайте индекс обучения (LI), определяемый как процентное снижение среднего CI у обученных мужчин по сравнению с наивными мужчинами (LI = (CInaïve –обученный CI) / CInaïve). Оцените LI для каждого дня тестирования и сравните его с кумулятивным LI, рассчитанным на основе всех дней тестирования вместе взятых.
- Создайте отдельный файл данных табуляции в две колонки с заголовками "Genotype" и "CI".
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти заголовки чувствительны к регистру. Название генотипа для каждой КИ должно состоять из описания генотипа, за которым следует подчеркивание и условие обучения (например, genotype_N и genotype_LTM и т. д., где N = наивный и LTM = долговременная память; см. пример в дополнительном файле S2). Эта аннотация необходима, так как функция analearn будет идентифицировать обученных и наивных мух на основе признаков, присутствующих после первого подчеркивания в столбце «Генотип».
- Используйте скрипт analearn R (дополнительный файл S3) для проведения рандомизационного теста, чтобы оценить статистическую значимость различий между значениями LI для разных генотипов.
- Исходный код сценария (дополнительный файл S3) в R, который определяет функцию с именем "analearn".
ПРИМЕЧАНИЕ: Определение функции: analearn <- function(nboot = 10,000, naivelevel = 'N', refmutation = NA, datname = NA, header = TRUE, seed = NA, writeoutput = TRUE).
- Запустите функцию, введя "analearn()" в командной строке R и выбрав файл данных для анализа (созданный на шаге 8.3) через всплывающее окно.
- Выберите референсную мутацию, которая является контрольным генотипом, введя соответствующее число и нажав Enter.
ПРИМЕЧАНИЕ: После выбора референсного генотипа скрипту требуется несколько секунд, чтобы выполнить 10 000 бутстреп-репликаций.
- Обратите внимание на таблицу выходных данных (табл. 3), которая содержит генотип, условие обучения (т.е. обучение, STM или LTM), среднее наивное ДИ, среднее обученное ДИ, LI, разницу между LI контрольной группы по сравнению с экспериментальным условием (LI dif), нижний предел (LL) и верхний предел (UL) 95% доверительного интервала LI dif, и p-значение, указывающее на вероятность того, что существенной разницы нет.
ПРИМЕЧАНИЕ: analearn сохранит выходной текстовый файл в каталоге, где находится файл данных. Тем не менее, таблица выводов также отображается в консоли R-Studio. Имя по умолчанию создается на основе имени предоставленного файла данных.
- В функции analearn есть несколько аргументов, которые можно использовать для изменения настроек функции по умолчанию для настройки параметров bootstrapping.
ПРИМЕЧАНИЕ: "nboot" определяет количество репликаций bootstrap и по умолчанию установлено на 10,000. Это значение может быть изменено на любое целое число больше нуля. В таблице 5 перечислено несколько аргументов, которые можно использовать для изменения настроек функции по умолчанию. Однако не рекомендуется использовать данные, полученные с небольшим количеством репликаций начальной загрузки.
