Этот протокол представляет собой выдержку из Qiang et al., A Burrowing/Tunneling Assay for Detection of Hypoxia in Drosophila melanogaster Larvae, J. Vis. Exp. (2018).
1. Подготовка личинок
- За два или более дней до начала анализа в чашках для откладывания яиц в соответствии с описанием Вишауса и Нуссляйн-Фольхарда в полипропиленовых стаканах объемом 50 мл и одноразовых чашках Петри диаметром 6,0 см, содержащих виноградный агар и смазанных дрожжевой пастой, непосредственно перед использованием. Держите мух в посуде для откладывания яиц в темноте при комнатной температуре до тех пор, пока это не понадобится.
- Рецепт виноградного агара – смешайте 100 мл замороженного 100% концентрата виноградного сока, 350 мл деиоинизированной воды, 5 мл ледяной уксусной кислоты и 13 г агара D. melanogaster в стакане объемом 1 л. Разогревайте в микроволновой печи очередями по 1-2 минуты, помешивая между очередями, пока агар полностью не растворится. Охладите раствор в течение нескольких минут, затем добавьте 10 мл 10% (w/v) нипагена (метил--гидроксибензоата) в 95% этанол. Перемешать, затем пипеткой по 7 мл на тарелку в одноразовые чашки Петри диаметром 6,0 см, дать загустеть и высохнуть при комнатной температуре в течение 3-4 часов. Хранить при температуре 4 °C в полиэтиленовых пакетах.
- Рецепт дрожжевой пасты – 7 г сухих дрожжей, 10 мл деионизированной воды, перемешать лопаткой до однородной консистенции.
- Своевременный сбор яиц для получения экспериментальных и контрольных личинок. Используя новые, смазанные дрожжами, виноградные пластины, соберите яйца при комнатной температуре в течение 4 часов в темноте в утренние часы. Снимите эти 4-часовые пластины для сбора и замените их свежими. Инкубируйте 4-часовые сборные планшеты в течение ночи при температуре 25 °C до полудня следующего дня, когда вылупится большая часть личинок. Соберите эти личинки первого возраста и используйте их для постановки эксперимента.
2. Настройка пробирных пластин
- Подготовка пробирных пластин. Для одного прогона анализа подготовьте пять пробирных пластин по 10 экспериментальных личинок и пять пробирных пластин по 10 контрольных личинок. С помощью пробкового сверла диаметром 1,5 см удалите центральную сердцевину агара с каждой тарелки, создав отверстие для еды. Нанесите в отверстие дрожжевую пасту (0,8 - 0,9 г) и аккуратно похлопайте шпателем, чтобы получился холмик, заполнив отверстие.
- Приготовление агаровой пластины – смешайте 700 мл деионизированной воды с 16 г агара D. melanogaster в стеклянном стакане объемом 2 л и разогрейте в микроволновой печи в течение 5 мин. Выньте из микроволновой печи и перемешайте стеклянным стержнем, чтобы добавить нерастворенный агар в раствор. Добавьте 17,5 мл 10% (по массе) нипагена в 95% этанол, перемешайте, затем продолжайте нагревание в микроволновой печи с периодами в 30 с с помешиванием, пока весь агар полностью не растворится. Остудите минуту-две, затем пипеткой по 15 мл аликвот в 10 см пластиковые чашки Петри. Дайте агару образоваться, накройте пластины крышками и дайте им высохнуть при комнатной температуре в течение нескольких часов или на ночь. Храните тарелки в герметичных пластиковых пакетах при температуре 18 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Чтобы избежать образования кристаллов Нипагена на поверхности пластин из-за избыточного высыхания, используйте пластины в течение нескольких дней после приготовления. При необходимости кристаллы можно повторно растворить, капнув на них несколько микролитров 95% спирта><.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: партии агара могут иметь разные желирующие свойства. Сухие гелевые пластины должны быть твердыми на ощупь и достаточно эластичными, чтобы можно было удалить чистый, неповрежденный круг агара при использовании пробкового точильщика для создания пищевого отверстия (см. выше).
- Закладка личинок в пробирные пластины. С помощью механического давления согнуть кончик пластикового микрошпателя и окуните кончик в дрожжевую пасту, чтобы обеспечить «клей» для сбора личинок. Подцепите личинок первого возраста по отдельности и положите их на агаровую тарелку рядом с пищевой горкой. Подготовьте не менее пяти репликационных пластин из 10 личинок как для экспериментального, так и для контрольного генотипов. После этого закройте крышкой и промаркируйте каждую пластину и установите пластины крышкой вверх в темное место при комнатной температуре (в нашей лаборатории это 22 °C).
3. Контрольные пробирные пластины
- Ежедневно осматривайте пластины под препарирующим микроскопом и записывайте количество личинок на верхней части пищи или на поверхности агара. Обратите внимание на видимые мертвые или умирающие личинки. Обратите внимание, когда и если туннелирование в агаровый субстрат наблюдается, когда личинки перемещаются в третий возраст. Отметьте даты, когда куколки начинают формироваться, и отметьте любые аномалии куколки. Продолжайте ежедневные наблюдения до тех пор, пока все личинки не умрут или не окукнутся.
- Осторожно извлеките куколки из тарелки изогнутой иглой и переложите на виноградную пластину. При желании продолжайте наблюдение за куколками, чтобы определить, сколько из них приближаются во взрослом состоянии.
