дрозофила Вскрытие имагинального диска личинками: метод наблюдения за развивающимися эпителиями

Аннотация

Источник: Моримото, К. и Тамори, Ю. Индукция и диагностика опухолей в эпителии имагинального диска дрозофилы. J. Vis. Exp. (2017).

При окрашивании имагинальных дисков дрозофилы, часто выполняется грубое вскрытие, где диски обнажаются, но остаются прикрепленными к телу. После окрашивания интересующие диски изолируются и монтируются. В примере протокола показана процедура рассечения и монтажа имагинального диска крыла.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Morimoto and Tamori, Induction and Diagnosis of Tumors in Drosophila Imaginal Disc Epithelia, J. Vis. Exp. (2017).

1. Вскрытие личинок

1. Соберите блуждающих личинки третьего возраста с помощью деревянной палочки или тупых щипцов, генотипируйте их соответствующими флуоресцентными маркерами (например, EGFP) под флуоресцентным стереоскопом и поместите в диссекционную чашку с PBS (фосфатно-солевой буфер).
2. Промойте личинок в PBS путем пипетирования пластиковыми переводными пипетками объемом 2 мл.
3. Одним щипцом зажмите центр личинки и другими щипцами разорвите тело пополам.
4. Одним щипцом зажмите крючок для рта передней половины, а другими щипцами толкните рот к телу, чтобы вывернуть тело наизнанку.
5. Удалите ненужные материалы, такие как слюнные железы или жировые тела, с помощью щипцов.

2. Фиксация и окрашивание антител

1. Переложите рассеченную переднюю половину тела личинки (включая имагинальные диски крыльев) в пластиковую трубку объемом 1,5 мл и зафиксируйте в 1 мл раствора Фикс (4% формальдегида в PBS) на 10 минут при комнатной температуре в темноте с осторожным вращением><. осторожность: Формальдегид токсичен и обладает канцерогенным потенциалом. Надевайте защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой части все действия происходят на нутаторе при комнатной температуре в темное время суток, если не указано иное.
2. Удалите раствор Fix и выбросьте. Промойте салфетки 1 мл PBT (0,3% Triton X-100 в PBS) три раза в течение 15 минут каждый.
3. Удалите ПБТ и добавьте 1 мл ПБТГ (0,2% бычьего сывороточного альбумина и 5% нормальной козьей сыворотки в ПБТ) для блокировки и нутать 1 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
4. Удалите ПБТГ и добавьте первичный раствор антител, соответствующим образом разбавленный ПБТГ (см. Таблицу материалов) и натугайте в течение ночи при температуре 4 °C.
5. Удалите первичный раствор антител и промойте ткани 1 мл PBT три раза по 15 мин каждый.
6. Удалите ПБТ и добавьте вторичный раствор антител, соответствующим образом разбавленный ПБТГ (1:400). Нутате в течение 2 ч при комнатной температуре или в течение ночи при 4 °C.
7. Удалите вторичный раствор антител и промойте ткани 1 мл PBT два раза по 15 мин каждый.
8. Чтобы окрасить F-актин, удалите PBT и добавьте раствор фаллоидина, соответствующим образом разведенный в PBS (1:40). Затем помешать в течение 20 минут. Удалите раствор фаллоидина и промойте салфетки 1 мл PBT два раза по 15 мин каждый.
9. Чтобы противопоставить ядерную ДНК, удалите PBT и добавьте раствор DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) (0,5 мкг/мл DAPI в PBS). Затем нутате 10 мин.<бр/> осторожность: DAPI обладает канцерогенным потенциалом. Надевайте защитные перчатки и одежду для предотвращения контакта с кожей.
10. Удалите раствор DAPI и промойте салфетки 1 мл PBT два раза по 15 мин каждый.
11. Промойте один раз в 1 мл PBS в течение 10 минут при комнатной температуре.
12. Удалите PBS и добавьте 500 мкл 100 % глицерина в качестве среды для предварительного монтажа.

3. Крепление на предметные стекла микроскопа

1. Поместите окрашенные ткани на предметное стекло микроскопа с помощью пластиковой переводной пипетки объемом 2 мл.
2. Перенесите ткани в капли крепежного средства на предметное стекло другого микроскопа с помощью щипцов.
3. Зажмите конец рассеченной ткани одним щипцом и оттяните ушные диски мозга и глаза другими щипцами.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сохраните расчлененный мозг, чтобы разместить его рядом с имагинальными дисками крыла. Мозг действует как платформа, предотвращая раздавливание покровного стекла имагинальных дисков крыла.
4. Чтобы изолировать имагинальные диски крыла, зажмите конец рассеченной ткани одним щипцом и аккуратно поцарапайте стенку тела, а другими щипцами оторвите диски.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если трудно найти имагинальные диски крыльев, отшелушите трахею с задней на переднюю сторону. Крыльевые имагинальные диски прилипают к трахее.
5. Аккуратно накройте имагинальные диски покровным стеклом и запечатайте лаком для ногтей; хранить при температуре 4 °C.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Реагентов
Фосфатно-солевой буфер (PBS)	Вако	162-19321
ТритонХ-100	Вако	168-11805
формальдегид	Вако	064-00406 (Английский
Бычий сывороточный альбумин	сигма	А7906
Нормальная козья сыворотка	сигма	Г6767
монтажный материал, Vectashield	Лаборатория «Вектор	Н-1000
DAPI	сигма	Д9542
мышь-анти-Dlg 4F3	Исследования в области развития, Банк гибридома	Антидиски 4F3 большие, RRID:AB_528203	развести в PBTG, 1:40
мышь-анти-MMP1	Исследования в области развития, Банк гибридома	3A6B4, RRID:AB_579780	3 Смешать 1:1:1 и развести в PBTG, 1:40
мышь-анти-MMP1	Исследования в области развития, Банк гибридома	3B8D12, RRID:AB_579781	3 Смешать 1:1:1 и развести в PBTG, 1:40
мышь-анти-MMP1	Исследования в области развития, Банк гибридома	5H7B11, RRID:AB_579779	3 Смешать 1:1:1 и развести в PBTG, 1:40
мыши-анти-атабулин	Исследования в области развития, Банк гибридома	AA4.3, RRID:AB_579793	развести в PBTG, 1:100
Alexa Fluor 546 Фаллоидин	Молекулярные зонды	А22283	развести в PBS, 1:40
антитело IgG к мышам козы, Alexa Fluor 546	Молекулярные зонды	А11030	развести в PBTG, 1:400
Штаммы мух
sd-Gal4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#8609	рекомбинированный с UAS-EGFP
upd-Gal4	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#26796	рекомбинированный с UAS-EGFP
UAS-lgl-РНКi	Венский центр РНК-интерференции дрозофил	#51247
UAS-scrib-RNAi	Венский центр РНК-интерференции дрозофил	#105412
БАС-РАС12	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#64196
БАС-Yki3SA	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#28817
hsFLP	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#6
Act>CD2>GAL4 (откидной GAL4)	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#4780	рекомбинированный с UAS-EGFP
БАС-EGFP	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#5428	Х-хромосома
БАС-EGFP	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#6658	третья хромосома
Беспилотный летательный аппарат Dicer2	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#24650	вторая хромосома
Беспилотный летательный аппарат Dicer2	Блумингтонский фондовый центр дрозофил	#24651	третья хромосома
vkg-GFP	Morin et al. 2001		Белковая ловушка GFP

гг. гг. ) »