Этот протокол является выдержкой из Immarigeon et al., A FACS-based Protocol to Isolate RNA from the Secondary Cells of Drosophila Male Accessory Glands, J. Vis. Exp. (2019).
1. Растворы и подготовка материалов
- Приготовьте следующие растворы.
- Приготовьте среду с добавками сыворотки (SSM): среда Schneider's Drosophila дополнена 10% инактивированной тепловой сывороткой плода крупного рогатого скота и 1% пенициллин-стрептомицином.
- Приготовьте аликвоты 1x фермента трипсина (например, фермента TrypLE Express) и храните при комнатной температуре.
- Приготовьте аликвоты папаина [50 ед/мл] (хранятся при -20 °C и размораживают только один раз).
- Приготовьте 1x фосфатный буферный раствор (PBS, хранящийся при комнатной температуре).
- Подготовьте несколько закругленных кончиков пипеток для физической диссоциации добавочных желез.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте насадки с низкой удерживающей способностью для работы с добавочными железами, так как они имеют тенденцию прилипать к необработанному пластику. Процесс закругления пламенем уменьшает раскрытие наконечника и сглаживает края наконечника. Это обеспечивает эффективную диссоциацию после расщепления пептидазы без сдвига клеточных мембран.
- Отрежьте один кончик объемом 200 мкл острым лезвием и осторожно проведите им над пламенем, чтобы закруглить его кончик так, чтобы отверстие было шире, но гладким для работы во время шага 2.7.
- Сузьте отверстие нескольких наконечников объемом 1 000 мкл, пропустив отверстие наконечника рядом с пламенем менее чем на одну секунду. Слегка поверните кончик, чтобы избежать переплавления или засорения. Отсортируйте сделанные кончики от более узких к более широким. Это можно сделать, замеряя скорость аспирации. Попробуйте разделить небольшую выборку АГ, чтобы проверить эффективность самых узких наконечников.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти наконечники имеют решающее значение для механического перемешивания. Качественные закругленные кончики пипеток обеспечивают полную диссоциацию при сохранении жизнеспособности клеток. Таким образом, эти наконечники тщательно промываются водой в конце процедуры для повторного использования. Это позволяет воспроизводить изо дня в день диссоциацию.
2. Рассечение добавочных желез
- Положите от 20 до 25 самцов дрозофил в стеклянную посуду на льду.
- Препарируйте 1 самца в SSM. Удалите его репродуктивный тракт и очистите пару добавочных желез от всех остальных тканей, кроме семяизвержительного протока.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите яички, потому что выделяющиеся сперматозоиды могут создавать комки и нарушать процесс диссоциации. Извлеките эякуляторную грушу, что затрудняет обращение с ней, когда она плавает.
- С помощью щипцов перенесите добавочные железы на стеклянную пластину, наполненную SSM комнатной температуры. Повторите шаги 2.2-2.3 20 раз для получения партии из 20 пар желез в SSM.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти шаги будут достигнуты за 15-20 мин. АГ должны выглядеть здоровыми, а перистальтические движения мышечного слоя вокруг желез должны быть видны. GFP можно контролировать с помощью флуоресцентного микроскопа.
- Перенесите добавочные железы в 1x PBS для промывания в течение 1-2 минут при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшей диссоциации обязательно нужно промыть железы с помощью PBS. Продолжительность этого этапа, однако, должна быть ограничена, так как клетки проявляют признаки стресса при PBS; диссоциированные вторичные клетки в PBS быстро набухают и погибают.
- Разведите 20 мкл папаина [50 ЕД/мл] в 180 мкл 1x фермента трипсина для получения диссоциативного раствора (для увеличения или уменьшения масштаба сохраняйте 9 мкл фермента трипсина и 1 мкл папаина для каждого самца). С помощью щипцов перенесите к этому раствору добавочные железы.
- Отделите кончик добавочных желез (содержащих вторичные клетки) от проксимальной части. С помощью тонких щипцов плотно зажмите середину железистой доли и разрежьте острым кончиком второго щипца. Удалите проксимальную часть добавочных желез и семявыводящий проток для улучшения диссоциации и сокращения времени сортировки клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассечение дистальной части из 20 пар желез займет от 15 до 20 минут, и таким образом пищеварение пептидазами начнется при комнатной температуре.
После того как - все кончики желез будут рассечены, перенесите их в пробирку объемом 1,5 мл с помощью специального наконечника пипетки объемом 200 мкл, приготовленного на Шаге 1.2.1. Перед обработкой желез он должен быть широким, округлым и влажным.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для пипетирования придаточных тканей железы наконечники всегда должны быть предварительно смочены соответствующим раствором (ферментом трипсина или SSM, держите для этой цели по одной пробирке каждого). Тщательно промойте наконечники между образцами, чтобы избежать загрязнения.