Drosophila melanogaster Диссекция яичников: техника препарирования тканей ex vivo

Аннотация

Источник: Parker, D. J., et al. Изучение структуры и функции митохондрий в яичниках дрозофилы. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает общую анатомию яичников дрозофилы и показывает метод препарирования яичников для живой или фиксированной визуализации.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из работы Parker et al., Study Mitochondrial Structure and Function in Drosophila Ovaries, J. Vis. Exp. (2017).

1. Подготовка дрозофилы (необходимые инструменты показаны в рисунок 1A)

1. Для любого из описанных экспериментов соберите дрозофил (при комнатной температуре или 25 °C) в течение 5 дней после выведения и поместите их во флакон, наполненный 5-7 мл пищи дрозофилы (см. Таблицу материалов), не более 25 мух в каждом флаконе; поддерживайте соотношение самки и самца 2:1.
2. Посыпьте небольшим количеством гранулированных дрожжей, чтобы стимулировать яйценоскость дрозофилы. Провести экспериментальную манипуляцию в течение 2 - 4 дней.

2. Вскрытие яичников дрозофилы (необходимые инструменты изображены в Рисунок 1A)

1. Нагрейте среду для препарирования насекомых (см. Таблицу материалов) до комнатной температуры, 25 °C. Заполните три лунки стеклянной чашки для препарирования на восемь лунок, по 200 мкл среды в каждую лунку.
2. Обезболите дрозофил _СО2, поместив иглу духового пистолета под пробку флакона. Поместите их на нахлыстовую площадку. С помощью препарирующего микроскопа отсортируйте 5 самок и поместите их в первую лунку анатомической чашки. Обрабатывайте по одной дрозофиле за раз при выполнении живой микроскопии.
3. Глядя в окуляр диссекционного микроскопа, отделите грудную клетку от брюшной полости с помощью двух пар щипцов. С помощью щипцов аккуратно перенесите брюшко во вторую лунку посуды.
4. Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать живот на заднем конце, и медленно выталкивайте яичники (вместе с другим содержимым брюшной полости) с помощью другой пары щипцов. Если эта попытка не удалась, осторожно удалите брюшной экзоскелет, вставив щипцы в передний конец для освобождения яичников.
5. С помощью щипцов держите отдельный яичник за непрозрачный задний конец (т.е. наполненные желтком яйца поздней стадии) и осторожно переместите его в третью лунку чашки для обработки для живой микроскопии или для фиксации для проведения иммуноокрашивания.
6. Осторожно подразните защитную оболочку вокруг яичников, слегка проводя иглой от заднего к переднему концу каждого яичника, удерживая его за задний конец с помощью щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы свести к минимуму повреждения во время поддразнивания иглы, согните кончик иглы и увеличьте масштаб каждого яичника, увеличив увеличение микроскопа (Рисунок 1A). Поддразнивание должно быть достаточно эффективным, чтобы разорвать влагалище, но оно также должно быть сделано осторожно, чтобы сохранить целостность овариолов.

Результаты

Рисунок 1: План эксперимента и подготовка. (А) Инструменты, используемые в описанных методах: А. Флакон с мухой; Б. Среда для препарирования насекомых; В. Параформальдегид; D. Щетка от мух; E. Препарирующая чашка; F. Покровное стекло; Г. Микрофуговая пробирка. H. Блюдо со стеклянным дном; I. Предметное стекло; J. микропипетка объемом 1 000 μл; K. микропипетка 200-μL; L. 2,5-μL микропипет...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Grace's Media (среда для анализа насекомых)	Научный центр Фишера	30611031-2
41 Параформальдегид AQ	Науки об электронной микроскопии	Тел.: 50-259-99
Полилизин	MP Biomedicals	ICN15017625
Флаконы с мухами	Научный центр Фишера	АС-515
Пробки для флаконов от мух	Научный центр Фишера	АС273
Jazzmix Drosophila food (Корм дрозофилы)	Научный центр Фишера	АС153
Azer Scientific EverMark Select Предметные стекла для микроскопа	Научный центр Фишера	Тел.: 22-026-252
Защитное стекло микроскопа	Научный центр Фишера	12-542-Б
Mat Tek Corp Стеклянное дно Блюдо Mircrowell	Научный центр Фишера	П35Г-0-14-К
Активные сухие дрожжи	Научный центр Фишера	ICN10140001
Щипцы Dumont #5	Технологии тонкой науки	11251-20
Moria Никелированный держатель штифта	Технологии тонкой науки	26016-12
Булавки Minutien	Технологии тонкой науки	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Блумингтонский фондовый центр	7194
Подстилка для мух	Летайте	59-118
Духовой пистолет	Летайте	54-104
Игла для духового пистолета	Мухи	54-119
Препарирующий микроскоп	Карл Цейсс	STEMI 2000