Этот протокол является выдержкой из Eidhof et al., High-throughput Analysis of Locomotor Behavior in the Drosophila Island Assay, J. Vis. Exp. (2017).
1. Строительство островного пробирного бокса
- Подготовьте поднос из прочного материала, такого как полиметилметакрилат (ПММА), чтобы содержать слой воды (т.е. ванну). Убедитесь, что материал не белый.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать размеры 40 x 35 x 2,5 см3 (рисунок 1A).
- Подготовьте коробку (42 x 38 x 25 см3) из прочного прозрачного материала, такого как ПММА, которая будет размещена вокруг ванны, чтобы предотвратить побег мух в лабораторное пространство. Поместите отверстие (20 x 30 см2) на боковой стороне, достаточно большое, чтобы экспериментатор мог легко взять в руки флаконы с мухами и бросить их на остров (Рисунок 1A).
- Подготовьте приподнятую платформу размером 10 x 15 x 2,5 см3 дюйма, изготовленную из водонепроницаемого материала (ПММА или пластика), который является водонепроницаемым.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта платформа должна иметь однородную белую поверхность, чтобы обеспечить хороший контраст для анализа изображений. Размер не обязательно фиксированный, но он должен быть достаточно большим, чтобы все мухи изначально приземлились на платформу и получили возможность пройтись по ней (Рисунок 1A).
- Закрепите платформу, приклеив ее к ванне или поместив грузы или другие тяжелые предметы внутрь коробки платформы, чтобы предотвратить изменение положения платформы во время экспериментальной/съемочной сессии.
2. Требования к программному обеспечению и установка
- Установка программного обеспечения для записи изображений.
- Загрузите программное обеспечение для записи изображений для записи серий изображений островов (см. Таблицу материалов) и установите программное обеспечение на компьютер.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение для записи изображений, описанное в этом протоколе, поддерживается только Windows. В Таблицу материалов добавлена альтернатива для других пользователей.
3. Подготовка мух к испытанию в островном анализе
- Соберите поэтапных мух для каждого экспериментального состояния под холодной анестезией или анестезией углекислым газом (CO2), как описано ранее (в течение 1 - 2 дней).
- Подготовьте минимум 3 флакона с образцами для каждого экспериментального условия, каждый из которых содержит примерно 15 постановочных мух. Используйте только мух с неповрежденными крыльями, одинакового возраста и пола.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для описанных здесь экспериментов было отобрано 5 образцовых флаконов, содержащих 15 самцов мух генотипов w-; Актин-Gal4/+ (контроль) и w-; Актин-Gal4/GD11950 (РНК тефу) были собраны в день эклозии, выдержаны в течение 4 дней и использованы для проведения островного анализа. РНК-интерференция, контрольные штаммы и драйвер Actin-gal4 были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов).
- Дайте мухам восстановиться, чтобы избежать эффектов от анестетиков (не менее 1 дня при использовании CO2) перед тестированием собранных мух в островном анализе в интересующем возрасте.
4. Экспериментальная установка
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1B.
- Добавьте в поддон для ванны холодную воду с небольшим количеством мыла и расположите платформу посередине><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыло снижает поверхностное натяжение воды; Мухи, которые коснутся воды, утонут. Это предотвращает увеличение количества мух, летающих в коробке во время прохождения экспериментальной сессии.
- Поместите прозрачный ящик на верхнюю часть лотка и подсвечивайте платформу сверху с помощью лампы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Подсветка платформы в основном требуется для обеспечения должного контраста видео. Для этого подойдет обычная светодиодная лампа на 12 В.
- Расположите веб-камеру прямо над платформой (за пределами коробки) и подключите ее к компьютеру.
- Создайте новые папки на компьютере для хранения различных экспериментальных данных до начала экспериментов.
- Следуйте структуре примера, показанного в Рисунок 2A, чтобы создать папки. Например, если план эксперимента требует тестирования двух генотипов с пятью репликациями каждый, сначала создайте основную папку, содержащую дату эксперимента. Внутри основной папки создайте две подпапки (по одной на каждый генотип). Внутри папок генотипа создайте пять новых подпапок, по одной на replicate.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для дальнейшего анализа важно, чтобы серии изображений, соответствующие отдельным экспериментам, сохранялись в папках с уникальными именами.
5. Настройка видео в разделе "Устройство захвата" интерфейса
- Откройте программное обеспечение для записи изображений и на вкладке «Захват» нажмите «Покадровые изображения...» и выберите соответствующую веб-камеру в качестве «Устройства захвата».
- Разместите на острове мертвую муху; отрегулируйте настройки видео, нажав на поле "Настройки видео". Прокрутите панели инструментов, регулируя яркость, контрастность и цвет таким образом, чтобы мертвая муха казалась черной на белом фоне (Рисунок 2B). Когда корректировки будут завершены, нажмите «Ok».
6. Настройка настроек записи и сохранения видео в разделе интерфейса "Таймлапс"
- Измените настройки в разделе "Time-Lapse Movie Setup", чтобы сохранить эксперимент в виде файла .avi. Нажмите на кнопку "Обзор...", выберите директорию, в которой будет храниться фильм, укажите название видео и нажмите кнопку "сохранить".
ПРИМЕЧАНИЕ: Видеофайл не используется для количественной оценки данных; Тем не менее, может быть полезно получить общее представление об эксперименте.
- Отрегулируйте настройки в разделе «Настройка интервальной видеосъемки».
- В поле сжатия выберите «Код Intel IYUV» для сжатия видео и выберите «Делать один кадр каждые 0,1 секунды» с параметром «Скорость воспроизведения (изображений в секунду):» на 10.
- Сохраните временные ряды эксперимента в виде .bmp кадров, нажав на кнопку "Дополнительно", выберите "Создать .bmp изображение для каждого захваченного кадра". Нажмите на кнопку "Обзор". Выберите тот же каталог в окне "Во время захвата видео AVI" (как указано в шаге 6.1), нажмите "Открыть" и нажмите "Ok".
ПРИМЕЧАНИЕ: Обратите внимание, что во время эксперимента кадры хранятся в виде файлов .bmp (необходимых для анализа данных). Программа называет кадры как "A", за которым следует номер, соответствующий последовательности захвата кадров (например, "A_number.bmp") (рисунок 2C). Всегда сохраняйте изображения, принадлежащие различным экспериментам, в новой папке, чтобы гарантировать, что ранее записанные серии изображений не будут перезаписаны. Имейте в виду, что изображения не сохраняются автоматически в той же папке, что и видеофайл, если только эта папка не выбрана в разделе «Обзор...» при нажатии на поле «Дополнительно».
7. Островной анализ и сбор данных
- Чтобы начать запись, нажмите кнопку «Пуск» в интерфейсе покадровой съемки программного обеспечения для записи изображений.
- Постучите по экспериментальному флакону с мухами (шаг 3) 2-3 раза, чтобы убедиться, что мухи находятся на дне флакона. Быстро выньте пробку флакона и энергичным движением постучите по флакону по платформе, чтобы все мухи одновременно упали на платформу (рисунок 1C).
- Примерно через 30 секунд нажмите кнопку "Стоп", чтобы остановить запись.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если все мухи исчезнут с платформы, запись можно остановить раньше.
- Удалите мух, которые остаются на платформе в течение 30 секунд, вручную после остановки записи изображения.
- Прежде чем приступить к записи следующего эксперимента, измените целевую директорию для файлов и фильмов .bmp (см. раздел 6).
