Протокол продолжительности жизни для Drosophila melanogaster: построение кривых выживаемости для выявления различий в продолжительности жизни мух

Аннотация

Источник: Bovier, T. F., et al. Методы тестирования эндокринных нарушений у Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2019).

Ученые используют протокол продолжительности жизни дрозофилы для измерения того, как различные условия эксперимента влияют на продолжительность жизни мух, и генерируют кривые выживаемости в процессе для количественной оценки экспериментальных результатов. Протокол отбора образцов включает в себя анализ, применяемый для изучения влияния на продолжительность жизни воздействия различных концентраций химических веществ-разрушителей эндокринной системы, или EDC, таких как 17-α-этинилэстрадиол (EE2).

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Bovier et al., Methods to Test Endocrine Disruption in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2019).

1. Приготовление пищи

1. Для поддержания запасов и роста личинок используйте среду из кукурузной муки, содержащую 3% порошкообразных дрожжей, 10% сахарозы, 9% предварительно приготовленной кукурузной муки, 0,4% агара, в дальнейшем называемую средой кукурузной муки (CM).
   1. Положите 30 г дрожжей в 100 мл водопроводной воды, доведите до кипения и дайте покипеть 15 минут.
   2. Отдельно хорошо смешайте 90 г предварительно приготовленной кукурузной муки, 100 г сахара и 4 г агара с 900 мл водопроводной воды.
   3. Доведите раствор до кипения, убавьте огонь и варите 5 минут, непрерывно помешивая.
   4. Через 5 минут добавьте горячий дрожжевой раствор и варите на медленном огне еще 15 минут.
   5. Выключите источник тепла и дайте раствору остыть примерно до 60 °C.
   6. Добавьте 5 мл/л 10% метил4-гидроксибензоата в этанол, тщательно перемешайте и оставьте на 10 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны с количеством метил-4-гидроксибензоата, учитывая, что высокая концентрация фунгицида может быть смертельной для личинок.
   7. Распределите среду по флаконам/флаконам: по 8 мл в каждый флакон с мухами (25 мм x 95 мм), по 3 мл в каждый флакон с мухами (22 мм x 63 мм) и 60 мл в каждый флакон с мухой (250 мл).
   8. Накройте флаконы марлей и дайте им высохнуть при комнатной температуре (RT) в течение 24 часов перед хранением.
   9. Экспериментально откалибруйте правильную консистенцию и гидратацию КМ, изменяя количество используемого агара и/или время охлаждения/сушки><. ПРИМЕЧАНИЕ: неподключенные, упакованные и упакованные флаконы стабильны около 15 дней при 4 °C.
2. Для взрослых дрозофил используйте среду, содержащую 10% порошкообразных дрожжей, 10% сахарозы, 2% агара, в дальнейшем называемую средой для взрослых (AM).
   1. Смешайте 10 г порошкообразных дрожжей, 10 г сахарозы, 2 г агара со 100 мл дистиллированной воды.
   2. Доведите эту смесь до кипения два раза, с интервалом в 3 минуты, или пока агар не растворится, используя микроволновую печь.
   3. Как только раствор остынет до 60 °C, добавьте 5 мл/л 10% метил-4-гидроксибензоата в этанол, тщательно перемешайте и разложите по флаконам (10 мл на флакон
   ).
   4. Перед хранением накройте флаконы марлей и дайте им высохнуть при RT в течение 24 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: неподключенные, упакованные и упакованные флаконы стабильны около 15 дней при 4 °C.

2. Дозирование EDC дрозофилы

1. Приготовьте соответствующий исходный раствор, растворив выбранный EDC в подходящем растворителе. Для EE2 (молекулярная масса 296,403) растворить 1,48 г в 10 мл 100% этанола с получением 0,5 М исходного раствора и хранить при температуре -80 °C.
   осторожность: EDC считаются загрязнителями окружающей среды, и при обращении с ними следует принимать меры предосторожности.
2. Развести стоковый раствор EE2 в 10% этаноле в воде (v/v) с получением 100 мМ раствора. Следующие разведения (0,1 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ) проводят в пище с КМ, начиная с самой низкой концентрации и используя одну и ту же конечную концентрацию растворителя для каждой группы обработки. Для контрольных флаконов используйте только растворитель того же объема.
   ПРИМЕЧАНИЕ: рекомендуется поддерживать конечную концентрацию растворителя как можно ниже, учитывая, что конечная концентрация этанола не должна превышать 2% в корме для мух.
3. Добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранного EDC, в пищу на основе кукурузной муки перед затвердеванием, тщательно перемешайте кухонным комбайном, разложите по 10 мл во флаконы, накройте ватной марлей и дайте высохнуть при RT в течение 16 часов перед использованием><. NOTE: используйте эту среду сразу после ее приготовления.
4. Для выращивания взрослых особей приготовьте различные рабочие растворы EE2 (10 мМ, 50 мМ и 100 мМ соответственно) в 10% этаноле в воде (v/v) и нанесите по 100 мкл каждого из них на поверхность АМ, чтобы получить желаемую концентрацию EE2 (0,1 мМ, 0,5 мМ и 1 мМ). Для контроля используйте только тот же объем растворителя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: в качестве альтернативы добавьте раствор, содержащий правильное разбавление выбранного EDC, в небольшое количество AM в коническую пробирку объемом 50 мл, тщательно перемешайте и расслойте 1 мл его на поверхность флаконов AM.
   1. Накройте флаконы ватной марлей, дайте высохнуть при RT в течение 12-16 часов при легком перемешивании и используйте их немедленно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: процесс сушки должен быть скорректирован экспериментально, потому что зависит от влажности окружающей среды.

3. Выращивание мух

1. Используйте устойчивый изогенный штамм, такой как Oregon R, поддерживаемый несколькими поколениями в лаборатории.
2. Храните мух во влажном инкубаторе с регулируемой температурой и естественным светом 12 часов: 12 часов темного фотопериода при 25 °C во флаконах, содержащих пищу CM.
3. В каждом анализе используйте флаконы на RT.

4. Протокол продолжительности жизни

1. Установите 20 флаконов с мухами с 8 самками и 4 самцами и поместите в помещение при температуре 25 °C в CM (10 мл каждая).
2. Через 4 дня выбросьте мух и поместите флаконы обратно в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: эти мухи могут быть использованы для повторного старта, чтобы получить другие синхронизированные по возрасту когорты мух.
3. Ближе к вечеру 9-го дня удалите всех только что закрытых мух из флаконов и верните флаконы в инкубатор.
   ПРИМЕЧАНИЕ: несколько взрослых должны начать закрываться уже на девятый день; Отбрасывание этих мушек позволяет собрать максимальное количество синхронизированных мух, избегая небрежного отбора ранних всходов.
4. Через 16-24 ч пересадите взрослых мух (в возрасте 1 дня) обоих полов в четыре группы по 250 мл флаконов, содержащих корм AM с добавлением трех различных концентраций EDC и один только растворитель. При необходимости соберите еще одну партию на следующий день.
5. Поддерживайте мух при температуре 25 °C в течение 2-3 дней, чтобы они могли спариваться.
   ПРИМЕЧАНИЕ: день перевода в ампликаторы с едой соответствует первому дню взрослой жизни.
6. Через два-три дня отсортируйте каждую когорту мух по полу на две группы под легким обезболиванием CO₂. Случайным образом разделите каждый пол на пять флаконов на обработку с плотностью 20 особей на флакон, пока не получится три повторения по 5 параллельных флаконов для каждого пола на каждую обработку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте с небольшими группами мух, чтобы предотвратить возможные долгосрочные проблемы со здоровьем из-за длительного воздействия_CO2.
7. Подготовьте таблицу продолжительности жизни, в которой количество мертвых мух вычитается из числа выживших мух до предыдущего переноса таким образом, чтобы автоматически получить количество выживших при каждом переносе.
8. Перекладывайте мух в новые флаконы, содержащие соответствующий корм, каждые 3 дня в одно и то же время и проверяйте на смерть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: перенос должен происходить без анестезии, которая может оказать долгосрочное негативное влияние на продолжительность жизни мух.
   1. При каждой передаче записывайте возраст мух и количество погибших мух.
      ПРИМЕЧАНИЕ: количество выживших мух автоматически рассчитывается в таблице, но рекомендуется проверить его визуально. Мух, которые случайно убегают или погибают во время переноса, не следует рассматривать. Будьте осторожны, чтобы не пересчитать дважды мертвых мух, перенесенных в новый флакон, сообщив об этом примечание в таблице.
   2. Повторяйте шаги 4.8 и 4.8.1 до тех пор, пока все мухи не умрут.
9. Для каждой группы лечения создайте кривую выживаемости, как показано на рисунке 1 Рисунок 1, чтобы отобразить вероятность выживания мухи в любой конкретный момент времени.
10. Проведите три независимых эксперимента для каждой группы мух, используя для каждого эксперимента 100 новых закрытых мух.
11. Подготовьте таблицу, в которой сообщите среднюю продолжительность жизни (среднее количество дней выживания всех мух для каждой группы), время полусмерти (период времени в днях, необходимый для достижения 50% смертности) и максимальную продолжительность жизни (максимальное количество дней, необходимое для достижения 90% смертности).
12. Рассчитайте разницу в процентном соотношении между каждой группой лечения по отношению к контрольной группе.
13. Выполнение статистического анализа для сравнения различных групп лечения.

Результаты

Рисунок 1: Кривые продолжительности жизни. Слева представлена репрезентативная таблица, в которой количество погибших мух регистрировалось каждые 3 дня, как для группы обработки (среда + EDC [0,05 мМ EE2]), так и для контрольной группы (среда + растворитель), на протяжении всего периода эксперимента. Средняя продолжительность жизни каждой группы была рассчитана с использованием метода MATRIX SUM. ПРОДУКТ;

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
17α-этинилэстрадиол	сигма	Е4876-1Г
Агар для дрозофилы средний	БИОСИГМА	789148
Кукурузной муки	CA' BIANCA
Флаконы с дрозофилами	БИОСИГМА	789008	25 мм x 95 мм
Флаконы с дрозофилами	БИОСИГМА	789009	29 мм x 95 мм
Флаконы с дрозофилами	Калтек	187	22 мм x 63 мм
этанол	ФЛЮКА	2860
Стеклянная бутылка			Флаконы 250 мл
Стеклянные флаконы	Микротехнологии	СТ 10024	Плоскодонная труба 100 x 24
Дрожжи Instant Success	ЭСКА		Порошкообразные дрожжи
Метил4-гидроксибензоат	сигма	Н5501
Стереомикроскоп со светодиодной подсветкой	Лейка		С4Е
сахароза	ХИМЕДИА	МБ025
Ручной блендер Pimmy	Ариете		кухонный комбайн

г.