$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Castells-Nobau et al., Two Algorithms for High-throughput and Multi-parametric Quantification of Drosophila Neuromuscular Junction Morphology, J. Vis. Exp. (2017).
1. Требования перед обработкой изображения
- Дрозофилы проводят открытую книжную подготовку блуждающих личинок третьего возраста (L3), как описано ранее.
- Ко-иммунометка терминалей Drosophila NMJ с использованием комбинации двух маркеров: Dlg-1 или Hrp вместе с Brp для анализа с помощью "Drosophila NMJ Morphometrics", и Syt или Csp вместе с Brp для анализа с помощью "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
ПРИМЕЧАНИЕ: Антитела одного и того же вида могут быть объединены путем предварительного мечения одного из них с помощью набора для конъюгации антител, такого как наборы для мечения Zenon Alexa.
- Визуализируйте терминалы NMJ с помощью микроскопа по выбору, например, флуоресцентной (с ApoTome или без него) или конфокальной микроскопии.
- Получение 2-канального стека изображений терминала NMJ.
- Отрегулируйте настройки микроскопа таким образом, чтобы канал 1 получал терминальный NMJ, иммуномеченный Dlg-1 (или Hrp, Syt, Csp), а канал 2 — терминальный NMJ, иммуномеченный Brp.
- При необходимости проанализируйте одноканальные изображения (синапсов, иммуномеченных одним антителом) с макросами. Изображение NMJs однозначно помечены с помощью Dlg-1 или Hrp для анализа с помощью "Drosophila NMJ Morphometrics", или Syt или Csp для "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
ПРИМЕЧАНИЕ: Невозможно проанализировать синапсы, окрашенные только анти-Brp.
- Экспортируйте полученные изображения в виде отдельных файлов .tiff. Инвертируйте порядок каналов перед запуском макросов, если они не получены должным образом.
2. Требования к программному обеспечению и установка
- Загрузите макросы: "Drosophila NMJ Morphometrics" и "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics" со следующего веб-сайта: https://doi.org/10.6084/m9.figshare.2077399.v1.
- Наведите курсор на папку "Macros update 1", и нажмите на появившуюся опцию "view". Появится список с содержимым этой папки. Папка содержит макросы "Drosophila NMJ Morphometrics" и "Drosophila NMJ Bouton Morphometrics".
ПРИМЕЧАНИЕ: Оба макроса совместимы с Fiji версии 1.4, которая также находится в той же папке. Макросы могут не запускаться в последних версиях. Пожалуйста, используйте предоставленную версию 1.4. Запустить эту версию без проблем даже на компьютерах с более поздней версией для Фиджи.
- Нажмите на кнопку "Скачать все". Содержимое папки будет загружено на компьютер в виде файла .zip. Распакуйте загруженный файл.
- Скопируйте файлы Drosophila_NMJ_Morphometrics.ijm и Drosophila_NMJ_Bouton Morphometrics.ijm в Fiji.app/plugins/ директорию. При перезапуске программы макросы появятся в нижней части выпадающего меню «Плагины».
3. Запустите подмакрос "Convert to Stack" для создания Z-проекций и гиперстеков изображений NMJ
- Запустите графический интерфейс, выбрав «Плагины» на панели инструментов, и выберите «Drosophila NMJ Morphometrics» в выпадающем меню.
- Определите настройку "Уникальная строка файла" в графическом интерфейсе макроса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение микроскопа использует идентификационную подпись для организации плоскостей и каналов при хранении стеков в виде отдельных файлов .tiff. Введенная уникальная строка файла должна указывать подпись, назначенную программой первой плоскости первого канала (важно: необходимо указать самую низкую плоскость и номер канала).
- Выберите только подмакрос "Convert to stack" и нажмите "ok" и выберите папку, где находятся изображения. Если выбран основной каталог с несколькими подпапками, будут обработаны все отдельные файлы '.tiff в основном каталоге и подпапке, соответствующие критериям уникальной файловой строки.
- Если z-стек содержит только один канал, установите флажок "Только канал 1".
- Обратите внимание, что на одно изображение NMJ будет отображаться два новых файла, которые по умолчанию называются stack_image_name и flatstack_image_name. Сохраняйте только эти стеки и плоские стеки для дальнейшего анализа. На этом этапе можно удалить .tiff ряд файлов, что минимизирует требуемый объем хранилища и позволяет избежать потенциальных источников ошибок.
4. Запустите подмакрос "Define ROI", чтобы определить интересующий терминал NMJ
- Запустите графический интерфейс "Drosophila NMJ Morphometrics".
- Выберите только флажок «Определить ROI» и нажмите «OK», выберите основную директорию, где хранятся изображения под названием flatstack_name и нажмите «Выбрать». Подмакрос "Define ROI" автоматически выполняет поиск по всем подпапкам в пределах выбранного основного каталога.
- Когда откроется первая проекция, выберите инструмент «Выбор от руки» на панели инструментов.
- С помощью мыши нарисуйте выделение, которое содержит исключительно весь интересующий терминал NMJ и нажмите "OK" в окне "Define terminal". Макрос перейдет к следующей проекции.
- Определите следующий ROI и повторяйте до тех пор, пока не будут определены все ROI. Файл изображения ROI с именем "roi_image_name" будет храниться в той же директории, что и ранее сгенерированные стековые и проекционные изображения для каждого из обработанных изображений. Результатом работы этого субмакроса является двоичное изображение ROI белым цветом на черном фоне.
5. Запустите подмакрос "analyze" для количественной оценки функций терминала NMJ
- Перейдите на панель инструментов, выберите «Плагины» и используйте:
"Drosophila_NMJ_Morphometrics" при анализе синапсов, иммуномеченных анти-Dlg-1 или анти-Hrp (канал 1) вместе с анти-Brp (канал 2), или "Drosophila_NMJ_Bouton_Morphometrics" при анализе синапсов, иммуномеченных анти-Syt или анти-Csp (канал 1) вместе с Brp (канал 2).
- При анализе стеков изображений одного канала (структурный канал Dlg-1 или HRP для "Drosophila_NMJ_Morphometrics, или Syt или Csp для "Drosophila_NMJ__Bouton_Morphometrics") установите флажок "Только канал 1".
- Отрегулируйте масштаб в соответствии с анализируемыми изображениями.
- Если один пиксель на изображении соответствует 2,5 мкм, укажите Scale-Pixels = 1, Scale-Distance in μm = 2,5. Если оба параметра оставить на 0, площадь NMJ, периметр, длина и длина самой длинной ветви будут выражены в количестве пикселей.
- При необходимости настройте параметры анализа макроса по умолчанию. Выполняйте корректировки только в том случае, если подмакрос "Анализ" ранее запускался с неудовлетворительными результатами (см. конец этого раздела и раздел 6 для инструкций по оптимизации настроек).
- Установите флажки «Анализировать» и «Подождать» и нажмите «ОК».
- Установите флажок "Wait" при запуске подмакроса "Analyze" на изображениях 2 каналов. В противном случае могут возникнуть ошибки при подсчете активных зон из-за ограниченных мощностей компьютера.
- Когда откроется новое окно "Выбрать директорию", выберите директорию, в которой находятся изображения, и нажмите "выбрать". Макрос проанализирует все изображения, хранящиеся в основном каталоге и, если применимо, в последующих папках (используя три файла из выполнения предыдущих подмакросов: stack_image_name, flatstack_image_name и roi_image_name). Макрос обрабатывает каждое изображение по отдельности и последовательно. Это может занять несколько минут на каждый стек изображений (в зависимости от мощности компьютера).
- После запуска макроса обратите внимание, что новый файл изображения с именем res_image_name для каждого анализируемого синапса будет создан в родительской папке. Количественные измерения будут храниться в виде файла "results.txt".
- Проверяйте все результирующие изображения, чтобы обнаруживать и исключать изображения с ошибками сегментации. Возможные ошибки сегментации описаны в таблице 1 вместе с рекомендациями по изменению настроек для обхода этих ошибок. Результирующие изображения с такими ошибками сегментации приведены в качестве примеров в Рисунок 1.
ПРИМЕЧАНИЕ: При запуске макроса с настройками по умолчанию, наблюдаемыми в пользовательском интерфейсе, точность составила примерно 95% при сравнении оценки макроса с ручной оценкой.
6. Настройте параметры макроса для изображений
- Если более 5% изображений показывают ошибки сегментации, изучите различные алгоритмы, чтобы определить/выбрать наиболее подходящие настройки макросов для изображений.
- Отрегулируйте значение радиуса катящегося шарика
ПРИМЕЧАНИЕ: Функция радиуса катящегося шара вычитает фон изображения. Эта функция имеет решающее значение при работе с изображениями, полученными на флуоресцентных микроскопах и/или при высоком уровне фонового шума. Вычитание фона поможет макросу с помощью шагов автоматического порогового значения произвести адекватную сегментацию терминалов NMJ.
- Выберите три изображения NMJ stack_image_name, сгенерированные подмакросом "Convert to stack". Выбирайте изображения, которые являются репрезентативными для набора данных изображений.
- На панели инструментов выберите Изображение | Цвет | Раздельные каналы. Будут созданы два стека изображений, один из которых представляет канал 1, а другой канал 2 соответственно, и они будут сохранены.
- Откройте стек изображений, принадлежащий каналу 1 открытым, соответствующий иммуномаркировке Dlg-1, Hrp, Syt или Csp.
- Запустите фильтр «Вычесть фон», выбрав «Обработать» на панели инструментов, а затем «Вычесть фон...» в выпадающем меню.
- Нажмите на флажок предварительного просмотра во всплывающем окне и отрегулируйте радиус катящегося шара до значения, наиболее подходящего для изображений. Настройка "Rolling ball radius" должна быть настроена на значения, которые увеличивают контраст между синапсом и фоном (см. Рисунок 2A').
- Смотрите Рисунок 2 для примера. На панели А части синапса показывают те же уровни серого, что и фон, тогда как на панели Рисунок 2 на панели А' "радиус катящегося шара" 500 приводит к сильному контрасту между синапсом и фоном.
- Создайте z-проекцию, выбрав на панели инструментов Изображение | Стек| Z-проекция, выберите тип проекции = Максимальная интенсивность и сохраните полученное изображение. Когда соответствующее значение радиуса катящегося шара определено, запустите алгоритм «Вычесть фон» на оставшихся репрезентативных изображениях с тем же значением радиуса катящегося шара. Создайте Z-проекции и сохраните их (в любой директории).
ПРИМЕЧАНИЕ: Значение радиуса катящегося шара для 8-битных изображений или изображений RGB должно быть по крайней мере таким же, как радиус самого большого объекта на изображении, который не является частью фона. Для 16-битных и 32-битных изображений радиус должен быть обратно пропорционален диапазону значений в пикселях.
- Определите различные автоматические пороговые значения, которые будут использоваться
- Откройте Z-проекции, сохраненные на предыдущем шаге (6.2.6) и выберите Изображение | Настройка | Автопорог | Попробуйте все.
- Поскольку появится двоичное пороговое изображение со всеми различными алгоритмами автоматического порога, определите наиболее подходящий алгоритм для изображений.
- При последующем запуске макроса измените порог в настройках макроса соответствующим образом.
- Используйте более ограничительные пороги, такие как "RenyiEntrophy" или "Moments", в качестве порога контура NMJ и более разрешающие пороги, такие как "Li" для определения скелета NMJ и "Huang" для определения активных зон. Когда изображения очень четкие с небольшим фоном или без него, используйте "Huang" в качестве порога контура NMJ. В противном случае части синапса могут отсутствовать после сегментации изображения.
- Смотрите Рисунок 2B для примера. Соответствующая сегментация синапса достигается с помощью автоматических порогов, выделенных зелеными прямоугольниками. Некоторые примеры неподходящих пороговых значений выделены красными прямоугольниками (проверьте синапсы при большом увеличении). В последнем случае либо отсутствуют части синапса, либо включены части фона.
- Определите максимальный размер мелких частиц
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция исключит из анализа все частицы, обнаруженные по порогу контура NMJ и порогу скелета, которые меньше значения, определенного в параметре «Малые частицы». Это значение определяется в пикселях. Эта функция служит фильтром шума и очень полезна, когда на полученных изображениях присутствуют высокие показатели неоднородного фона (например, кристаллов/пыли).
- Откройте Z-проекции, сохраненные на шаге 6.2.6. и установите масштаб для определения количества пикселей с помощью команды Анализ | Установите масштаб. Примените следующие настройки: расстояние в пикселях = 1, известное расстояние = 1, соотношение сторон пикселя = 1, единица длины = пиксель и нажмите "Ok". Нажмите на инструмент «Овальное выделение» на панели инструментов.
- С помощью мыши нарисуйте выделение, близко окружающее отдельные частицы, которые присутствуют в иммуноокрашивании, но не принадлежат к NMJ. Нажмите Ctrl+m для пользователей Windows или cmd+m для пользователей Mac. Откроется окно с результатами, в котором будет указана площадь выбранных частиц по количеству пикселей.
- Повторите предыдущий шаг несколько раз с несколькими артефактами, присутствующими на изображениях, чтобы определить самую большую область загрязнения частиц/артефактов. Это значение будет установлено в настройках при последующем запуске макроса. При запуске макроса установите "Small Particles Size" в качестве наименьшего наблюдаемого размера частиц гноя с запасом 25%.
- Смотрите Рисунок 2D для примера. Самый большой обнаруженный кристалл имеет площадь 112 пикселей. Настройка "Размер мелких частиц", при обработке этого изображения макросом, должна быть установлена на 125 - 150.
- Определение минимального размера бутона
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта функция исключит из анализа все бутоны, обнаруженные по пороговому значению контура NMJ, которые меньше заданного значения. Это значение определяется в пикселях.
- Выполните те же действия, что описаны в разделе 6.4, но в этом случае нарисуйте выделение вокруг самых маленьких бутонов, присутствующих в терминале NMJ. Выберите наименьшую площадь, соответствующую наименьшему бутону из измеренных. Это значение, которое должно быть установлено в настройках минимального размера бутона при последующем запуске макроса.
- Определите значение "Максимальная толерантность к шуму"
- Чтобы определить значение "Найти максимум допуска шума" для макроса, откройте Z-стек канала 2, сохраненный в разделе 6.2.2.
- Перейдите на вкладку плагинов во всплывающем меню, выберите Процесс | Максимум(3D), и когда появится maximum_image_name (что может занять несколько минут), закройте исходный стек изображений.
- Выберите Maximum..._image_name (только что полученный стек изображений) и выберите Плагины | Процесс | Minimum (3D), когда новое изображение Minimum of Maximum..._image_name закрывает стек Maximum... _image_name
.
- На панели инструментов выберите Процесс | Найти максимы.... Откроется новое окно "Найти максимумы...". Установите флажок "Предварительный просмотр выбора точки..." и заполните поле "Устойчивость к шуму" с настройкой макроса по умолчанию 50. Точки максимумов будут обозначены на изображении маленькими крестиками.
- Увеличивайте значение "Устойчивость к шуму", если наблюдаете избыток аннотированных активных зон, т.е. пересечений, которые не находятся поверх активных зон, которые не находятся в фокусе на выбранной плоскости стека, или ложных активных зон, которые обнаруживаются на заднем плане.
- С другой стороны, если вы наблюдаете не полностью аннотированные активные зоны, т.е. активные зоны в фокусе не распознаются, уменьшите значение "Maxima noise tolerance". Продолжайте пробовать разные значения после этой процедуры, пока крестики не обозначают активные зоны в фокусе. Заполните поле "Find maxima noise tolerance" этим значением.
- Смотрите Рисунок 2C для примера. Обнаруживается слишком много активных зон. В Рисунок 2C' при увеличении значения "Maxima noise tolerance" обнаруживаются только активные зоны в фокусе.
- Запустите подмакрос "Анализ" для репрезентативных изображений, выбранных на шаге 5.1, с настройками, определенными на всех предыдущих шагах.
- Настройка Brp-puncta нижнего и верхнего порога
- Обратите внимание, что после запуска макроса в соответствии с шагом 6.6 появится новый файл, называемый 2_active_zone_stack_image_name. В этом стеке изображений активные зоны, обнаруженные функцией "Найти максимумы", обозначены белыми точками в каждой плоскости.
- Откройте этот файл, перетащив его на панель инструментов, и выберите Изображение | Стек | Z-проект | Тип проекции = Сумма срезов. Будет получена проекция 2_active_zone_stack_image_name.
- Выбрать изображение | Настройка | Порог. Откроется новое окно "Порог". Сдвиньте верхнюю полосу, чтобы выбрать пороговое значение, при котором все желаемые фокусы/Brp-положительные точки визуализируются красным цветом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если пороговое значение установлено слишком низким, будет засчитано превышение активных зон. Если установить слишком высокий уровень, часть активных зон будет пропущена.
- Смотрите Рисунок 2E для примера. Когда порог установлен на 400, большинство активных зон (обозначенных как фокусы размером 1 пиксель) не включаются в сегментацию, так как они не подсвечиваются красным цветом (Рисунок 2E). Когда пороговое значение равно 50, все активные зоны подсвечиваются красным цветом (рисунок 2E').
- Определите это значение как минимальное пороговое значение. Оставьте "Верхний порог пунктики" на максимальном значении.
- Повторно запустите подмакрос "Анализ" для репрезентативных изображений с настройками, определенными во всех предыдущих шагах этого раздела. Критически оцените полученные файлы изображений и убедитесь, что сегментация выполнена правильно. Если это не так, измените настройки в соответствии с характером ошибок сегментации (Рисунок 1, Таблица 1).
