Двухфотонное лазерное повреждение нервной системы: метод наблюдения за дегенерацией и регенерацией аксонов у личинок дрозофил

Аннотация

Источник: Li, D., et al. Модель повреждения дрозофилы in vivo для изучения нейрорегенерации в периферической и центральной нервной системе. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает двухфотонную лазерную абляцию аксонов у личинки Drosophila melanogaster и пример протокола для индуцирования травмы и визуализации места повреждения.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Li et al., A Drosophila In vivo Injury Model for Study Neuroregeneration in the Peripheral and Central Nervous System, J. Vis. Exp. (2018).

1. Двухфотонная травма и конфокальная визуализация

1. Настройка микроскопа
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента был использован конфокальный лазерный сканирующий микроскоп с двухфотонным лазером, но других систем с эквивалентной установкой будет достаточно. Двухфотонный лазер (930 нм) был использован для доставки травмы, а аргоновый лазер (488 нм) был использован для конфокальной визуализации GFP.
   1. В начале каждого сеанса включайте двухфотонный лазер и/или конфокальный лазер (лазеры), а также микроскоп. Откройте программное обеспечение для обработки изображений.
   2. Для двухфотонной травмы настройте следующие параметры для визуализации GFP с помощью двухфотонного лазера на длине волны 930 нм (1950 мВт).
      1. Выберите режим линейного сканирования. Откройте отверстие до упора. Увеличьте интенсивность лазера до ~20% (390 мВт).
      2. Выберите 512 x 512 в качестве кадрового сканирования. Используйте максимальную скорость сканирования (обычно с временем задержки пикселя 0,77 мкс). Убедитесь, что среднее число равно 1, а разрядность — 8 бит.
      3. Установите усиление на ~750, а смещение на 0.
      4. Сохраните этот предустановленный экспериментальный протокол в качестве абляции 2P GFP 930, что позволит легко использовать его в будущих экспериментах.
   3. Для конфокальной визуализации необходимо настроить следующие параметры визуализации GFP с помощью аргонового лазера на длине волны 488 нм:
      1. Выберите вкладку Acquisition (Приобретение), а затем Z-stack (Z-stack).
      2. В разделе "Laser" включите питание для аргонового лазера с длиной волны 488 нм.
      3. Перейдите в раздел «Каналы», выберите лазер 488 мм и увеличьте мощность лазера до 5-10%. Для отверстия используйте 1-2 воздушные единицы (AU). Отрегулируйте усиление на 650.
      4. В режиме съемки выберите 1024 x 1024 в качестве сканирования кадра, используйте максимальную скорость сканирования, среднее число 2 и битовую глубину 8 бит.
      5. Сохраните этот предустановленный экспериментальный протокол как GFP Imaging.
2. Обезболивание личинок диэтиловым эфиром и монтирование
   1. В вытяжной шкаф поместите стеклянную тарелку диаметром 60 мм в пластиковую чашку Петри диаметром 15 см. Сложите и постелите на дно стеклянной посуды лист папиросной бумаги, затем положите на ткань пластину с агаром виноградного сока. Добавьте диэтиловый эфир в стеклянную посуду до такой степени, чтобы папиросная бумага пропиталась и в посуде остался слой жидкого эфира. Всегда держите крышку закрытой.
   2. Подготовьте предметное стекло с одной каплей масла галоидоуглерод 27 в центре. Добавьте 4 пятна вакуумной смазки на четыре угла предметного стекла, чтобы позже поддержать покровное стекло.
   3. С помощью щипцов возьмите очищенную личинку и поместите ее на агаровую пластину в стеклянную посуду диаметром 60 мм. Накройте стеклянную посуду крышкой и подождите, пока личинка перестанет двигаться. Для получения травмы/визуализации ПНС удалите личинку, как только ее хвост перестанет дергаться. Для ЦНС дождитесь, пока вся личинка станет неподвижной, особенно головные сегменты.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время воздействия эфира имеет решающее значение. Смотрите обсуждение.
   4. Осторожно возьмите в руки личинку, находящуюся под наркозом, и поместите ее вертикально в каплю галоидоуглеродного масла на предметном стекле. Добавьте покровную крышку в верхней части предметного стекла. Слегка надавливайте на покровное стекло, пока оно не коснется личинки (Рисунок 1A).
   5. Отрегулируйте положение личинки, осторожно надавливая покровное стекло влево или вправо, чтобы перекатить личинку так, чтобы интересующий вас нейрон/аксон/дендрит находился сверху и ближе всего к линзе микроскопа.
   6. При повреждении ПНС установите личинку спинной стороной вверх так, чтобы были видны обе трахеи. Затем поверните личинку на ~30 градусов влево для повреждения аксонов нейронов класса III (Рисунок 1B и 1C), на 90 градусов для повреждения аксонов нейронов класса IV (Рисунок 1B и 1E), или на ~30 градусов для повреждения дендритов нейронов класса IV (рисунок 2A).
   7. При повреждении ЦНС расположите личинку идеально вентральной стороной вверх (Рисунок 3A), чтобы интересующая область была ближе всего к линзе микроскопа в z-плоскости.
3. Травма двухфотонным лазером
   1. Поместите предметное стекло с личинкой под микроскоп и закрепите его на месте с помощью держателя предметного стекла на предметном столике. Используйте цель 10X (0,3 NA), чтобы найти личинку.
   2. Добавьте 1 каплю объективного масла на покровное стекло, переключитесь на объектив 40X (1,3 NA) и отрегулируйте фокусировку.
   3. Переключитесь в режим сканирования и повторно используйте экспериментальный протокол 2P GFP 930 Ablation. Убедитесь, что отверстие полностью открыто.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Конфигурация должна быть оптимизирована с учетом индивидуальных систем.
   4. Запустите режим Live для определения области интереса (ROI) и выполните точную настройку параметров, чтобы добиться хорошего качества изображения при соответствующем масштабировании.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Цель этого шага состоит в том, чтобы найти нейрон/аксон/дендрит для травмы, а не получить изображение наилучшего качества. Поэтому используйте минимальные настройки, достаточные для визуализации целевой области, во избежание пересвета или фотообесцвечивания.
   5. Остановите сканирование в реальном времени, чтобы кнопка «Обрезать» стала доступна. Пусть неподвижное изображение послужит дорожной картой. Выберите функцию «Кадрирование» и настройте окно сканирования, чтобы сфокусироваться на цели, которую нужно ранить.
   6. Уменьшите ROI до размера предполагаемого места травмы. Например, просто закройте ширину аксона или дендрита, чтобы обеспечить точность травмирования и уменьшить повреждение соседних тканей. При желании увеличьте рентабельность инвестиций перед обрезкой, что позволит более точно наносить травмы.
   7. Откройте новое окно изображения. Уменьшите скорость сканирования и увеличьте интенсивность лазера. Определение увеличения интенсивности лазера на основе сигнала флуоресценции тканей, отсканированного в режиме Live.
   8. Как правило, устанавливают интенсивность двухфотонного лазера, начиная от 25% для повреждения ПНС и 50-100% для повреждения ВНК. При повреждении аксонов ПНС убедитесь, что интенсивность лазера составляет ~480 мВт, а время задержки пикселей — 8,19 мкс. Для повреждения аксонов VNC убедитесь, что интенсивность лазера и время задержки пикселей обычно составляют 965-1930 мВт и 8,19-32,77 μс соответственно.
   9. Запустите непрерывное сканирование. Оставьте курсор наведенным на кнопку Непрерывно. Внимательно следите за изображением и остановите сканирование, как только будет замечено резкое увеличение флуоресценции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Появление флуоресцентного спайка обусловлено аутофлуоресценцией в месте травмы.
   10. Переключитесь обратно в режим Live, повторно используя настройки. Найдите область интереса, которая только что была выбрана, настроив фокус.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошим признаком успешной травмы является появление небольшого кратера, кольцевидной структуры или локализованных обломков прямо на месте травмы.
   11. Перейдите к следующему нейрону и повторите шаг 1.3.5, чтобы повредить несколько нейронов у одного животного. Или повторите шаг 1.3.5, постепенно увеличивая мощность и/или уменьшая скорость сканирования, если первоначальная травма была недостаточной.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В случае, если мощность лазера слишком высока, на снимке сканирования в реальном времени после травмы будет видна большая поврежденная область. Слишком сильная травма может стать причиной гибели личинки.
   12. Восстановите личинку, осторожно сняв покровный листок и переложив поврежденную личинку на новую пластину с дрожжевой пастой. Вырыть несколько пещер на агаровой плите щипцами; В качестве альтернативы сделайте островок из агара в тарелке вместо использования всей тарелки, чтобы уменьшить возможность выползания личинки из тарелки.
   13. Поместите планшет в 60-миллиметровую чашку Петри с влажной салфеткой (смоченной 0,5% раствором пропионовой кислоты) и заквашивайте при комнатной температуре или 25 °C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Личинка будет оставаться в личиночной стадии примерно на дополнительные сутки при комнатной температуре (22 °C) по сравнению с 25 °C.
4. Посттравматическая конфокальная визуализация
   1. Визуализируйте поврежденную личинку в желаемые моменты времени, подготовив личинку с помощью той же процедуры анестезии и монтирования, что и в шаге 1.2, затем визуализируйте с помощью конфокального лазера><. ПРИМЕЧАНИЕ: Визуализируйте личинку через 24 ч после травмы (AI) для подтверждения аксонального повреждения и через 48 ч AI (da нейроны IV класса) или через 72 ч AI (da нейроны III класса) для оценки регенерации.
   2. Найдите личинку с помощью объектива 10X, затем переключитесь на объектив 25X (0,8 NA). Повторно используйте экспериментальный протокол GFP Imaging.
   3. Нажмите кнопку «Активировать» и найдите тот же нейрон, который был поврежден ранее.
   4. Установите первое и последнее положение по оси Z в окне сканирования в реальном времени. Нажмите кнопку Стоп и нажмите кнопку Начать эксперимент, чтобы получить изображение Z-стека.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что точка нормализации (точка сходимости аксонов) включена при захвате изображений, чтобы можно было количественно оценить регенерацию (Рисунок 1D, 1F) - это обсуждается далее в разделе анализа данных.
   5. Переключитесь в режим «Обработка изображений», выберите только что сделанное изображение и сгенерируйте проекцию максимальной интенсивности. Сохраните изображения проекции z-стека и проекции максимальной интенсивности.

Результаты

Рисунок 1: Регенерация аксонов Da нейронов на периферии проявляет классовую специфичность. (А и В) Схематический рисунок, показывающий положение личинок. (В) Схематический рисунок нейронов класса III da. (D) Аксоны нейронов ddaF класса III, помеченные 19-12-Gal4, UAS-CD4-tdGFP, repo-Gal80/+, не восстанавливаются. (E) Схематический рисунок нейронов класса...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Диэтиловый эфир, реагент ACS, безводный	Акрос Органик	AC615080010
Галокарбон 27 Масло	Дженеси Сайентиал	59-133
Пропионовая кислота	Джей Ти Бейкер	У33007
Чехлы для покрытия: прямоугольники	Научный центр Фишера	12-544-Д	50 мм X 22 мм
Лазерный сканирующий микроскоп Zeiss LSM 880	Цейсс
Программное обеспечение Zen	Цейсс
Хамелеон Ультра II	когерентный