$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол взят из Catrina et al., Visualizing and Tracking Endogenous mRNAs in Live Drosophila melanogaster Egg Chambers, J. Vis. Exp. (2019).
1. Проектирование MB для визуализации живых клеток
- Сверните последовательность РНК-мишени, чтобы предсказать вторичную структуру мишени мРНК, используя «форму РНК» с сервера mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
- Вставьте/загрузите целевую последовательность в формате FASTA, выберите 5 или 10% субоптимальности (структуры со свободной энергией сворачивания в пределах 5 или 10% от значения MFE соответственно) и соответствующим образом отрегулируйте максимальное количество вычисляемых сворачиваний (например, больше для 10% субоптимальности).
ПРИМЕЧАНИЕ: Включение субоптимальных вторичных структур при проектировании МБ позволяет идентифицировать участки внутри мишени мРНК, которые могут быть более гибкими или более жесткими, чем прогнозируется только для структуры с минимальной свободной энергией (MFE), что улучшает общий дизайн МБ, пригодный для визуализации живых клеток.
- Выберите «немедленное задание» для мишеней мРНК с 800 нуклеотидами (nt) или «пакетное задание» для мРНК с длиной от 801 до 8 000 nt. Сохраните файл «ss-count» в виде простого текстового файла.
- Используйте файл "ss-count", полученный на шаге 1.1, в качестве входных данных для программы PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) с желаемыми параметрами, чтобы спроектировать несколько МБ для мишени мРНК (см. учебные пособия, описывающие использование программы PinMol по адресу https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
- Определите специфичность выбранных МБ с помощью анализа BLAST: используйте "blastn" с соответствующей базой данных (например, для мРНК-специфичных МБ oskar используйте базу данных "refseq-rna" и организм Drosophila melanogaster).
- Определите любую тканеспецифичную экспрессию мишени мРНК (например, для oskar mRNA Flybase> High-Throughput Expression Data> FlyAtlas Anatomy Microarray или modENCODE Anatomy RNA-Seq; http://flybase.org/reports/FBgn0003015) и сравнить с любыми положительными хитами BLAST. Исключите зонды, которые демонстрируют >50% перекрестную гомологию с другими мРНК, которые также экспрессируются в интересующей ткани/клетке.
- Выберите пару флуорофор и гаситель, подходящую для микроскопии, доступной для визуализации живых клеток (например, Cy5/BHQ2).
2. MB Синтез, очистка и определение характеристик
- Используйте собственный синтез и очистку, как описано ранее в Bratu, Methods in Molecular Biology (2006), или услуги коммерческих поставщиков для синтеза и очистки от одного до пяти MB (см. примечание выше), используя следующую схему маркировки: [5'(Флуорофор)-(С3 или С6 линкер)-(2'-O-метиловая последовательность МБ)-(Гаситель)3']. Очистите MB с помощью обратной фазы ВЭЖХ, собственными силами или с помощью услуг коммерческого поставщика.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фосфорамидиты, используемые для автоматизированного синтеза зондов, должны иметь модификацию 2'-O-метилрибонуклеотида. Можно также использовать химеры чередующихся модифицирований заблокированных нуклеиновых кислот (LNA) и 2'-O-метила для повышения стабильности гибрида между более короткой MB и его целевой мРНК.
- Синтезируйте олигонуклеотиды ДНК, которые соответствуют последовательности целевой области РНК и, таким образом, комплементарны зондирующей области МВ, для использования в характеристике in vitro (см. шаги 2.3 - 2.5; примечание выше). Максимизируйте гибридизацию МВ с мимишенью ДНК-олигонуклеотида путем включения на каждом конце ДНК-мишени четырех дополнительных нуклеотидов, как это обнаружено в последовательности мРНК><-мишени.
ПРИМЕЧАНИЕ: Более строгая характеристика эффективности MB для обнаружения целевой последовательности может быть выполнена с использованием мишеней in vitro, синтезированных РНК вместо комплементарных олигонуклеотидов ДНК.
- Выполните термическую денатурацию только MB, измерьте температуру ее плавления (Tm) и убедитесь, что MB принимает желаемую форму шпильки при физиологической температуре. Мы наблюдали значения Tm в диапазоне от 60 до 90 °C.
- Выполните термическую денатурацию МВ в присутствии мишени олигонуклеотида ДНК и измерьте Tm гибрида-мишени МБ:ДНК, как описано ранее в Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Tm в диапазоне от 55 до 60 °C желателен для гибрида MB:DNA.
- Провести реакции гибридизации in vitro с соответствующей мишенью олигонуклеотида ДНК и определить эффективность образования гибрида MB:ДНК при физиологической температуре, как описано ранее в Bratu, Methods in Molecular Biology (2006). Желательна быстрая кинетика гибридизации с имитацией мимии ДНК-мишени, однако МБ, которые не демонстрируют высокой эффективности гибридизации с мишенями ДНК, могут иметь лучшие результаты с мишенями-мишенями in vitro и/или in vivo.
3. Вскрытие и подготовка отдельных яйцеклеток к микроинъекции
- Только что вылупившихся, спаренных самок кормите в течение 2-3 дней свежей дрожжевой пастой.
- Обезболите мух на подушечке CO2 и, используя тонкий пинцет (Dumont #5), пересадите 1-2 самки в каплю Halocarbon oil 700 на стеклянной крышке.
- С помощью пинцета сориентируйте муху тыльной стороной вверх под стереомикроскопом. Рассеките женский живот, сделав небольшой разрез на заднем конце, и аккуратно выдавите пару яичников в масло.
- Эксплантируйте завязи на масляную каплю на новом покровном листе. Осторожно придерживайте одним пинцетом один яичник, одновременно отщипывая самыми молодыми стадиями овариола другим пинцетом. мРНК оскара активно локализуется в середине оогенеза и после него (стадии > 7), а более молодые яйцеклетки (стадии < 7) труднее вводить и они не выживают так долго. Медленно тяните за крышку (движением вниз) до тех пор, пока отдельные овариолы или камеры для яиц не будут изолированы и не выровнены по вертикали. Далее отделите одиночные яйцевые камеры, вытеснив нежелательные стадии из яичной цепи овариоля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следите за тем, чтобы камеры для яиц не плавали в масле и прилипали к крышке. Это важно как для успешной микроинъекции, так и для получения изображения.
4. Микроинъекция MB в клетки-медсестры яйцевых камер
- Приготовьте раствор MB, используя один молекулярный маяк (например, osk2216Cy5) или комбинацию двух MB, которые нацелены на разные мРНК и помечены спектрально различными флуорофорами (например, osk2216Cy5 и drongo1111Cy3). Используйте концентрацию 200-300 нг/мкл каждого МБ в HybBuffer (50 мМ Tris-HCl - pH 7,5, 1,5 мМ MgCl2 и 100 мМ NaCl). Для коктейля из четырех МБ, меченных одним и тем же флуорофором, которые нацелены на одну и ту же мРНК в концентрации 200 нг/мкл каждая в HybBuffer (например, osk82, osk1236, osk2216). Раскрутите раствор MB непосредственно перед загрузкой иглы для микроинъекций.
- Выберите цель. Для поиска подходящей яйцевой камеры и проведения микроинъекций рекомендуется использовать масляный объектив 40x.
- Установите покровное стекло с рассеченной яйцевой камерой на предметный столик микроскопа. Поднимите объектив в положении фокусировки и определите яйцеклетку на средней и поздней стадии развития, которая правильно ориентирована для микроинъекции (т.е. с осью AàP, перпендикулярной кончику иглы, чтобы обеспечить легкую инъекцию в клетку-медсестру проксимальнее ооцита).
- Загрузите иглу (коммерческую или приготовленную на месте) с ~1 μл раствора MB (см. шаг 1.1) и подключите ее к микроинъектору. Для микроинъекций в яйцевые камеры D. melanogaster следует направлять иглу (см. Таблицу материалов) под углом <45° к предметному столику микроскопа (например, 30°), чтобы избежать прокола нескольких клеток-кормилиц.
- Установите инжектор с давлением впрыска 500-1 000 гПа и компенсационным давлением 100-250 гПа (см. Таблицу материалов).
- Медленно перемещайте сценку, чтобы в поле зрения оказалась область масляной капли, свободная от яйцевых камер.
- С помощью джойстика-микроманипулятора аккуратно опустите иглу в каплю масла и сфокусируйте ее кончик в сторону периферии поля зрения.
- Выполните функцию «очистки» для удаления воздуха с кончика иглы и обеспечения потока от иглы.
- Приведите иглу в исходное положение и сфокусируйтесь на яйцевой камере, в которую необходимо сделать микроинъекцию, затем верните иглу в фокус и расположите ее у края яйцевой камеры.
- Выполните точную регулировку Z-положения объектива таким образом, чтобы мембрана, отделяющая клетки фолликула от клеток медсестры, оказалась в фокусе.
- Введите иглу в камеру медсестры и выполняйте инъекцию в течение 2-5 с.
- Аккуратно извлеките иглу и верните ее в исходное положение.
- Измените объектив на желаемое увеличение для получения изображения (60-63x или 100x), сфокусируйтесь на камере для яиц и начните съемку.