Скрининг геномных модификаций: метод идентификации мутантов, сгенерированных CRISPR, у дрозофил

Аннотация

Источник: Du, L., et al. Эффективная стратегия генерации тканеспецифичных бинарных транскрипционных систем у дрозофил путем редактирования генома. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает метод скрининга для идентификации трансгенных мух дрозофилы, чей геном был изменен с помощью CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 — это мощный инструмент редактирования генома, который произвел революцию в том, как ученые могут манипулировать геномом организма. В примере протокола мы увидим, как идентифицировать мутантов, сгенерированных CRISPR, в которых вставка трансактивационной последовательности заменяет первый экзон гена без ветвей (bnl), создавая таким образом ген-специфичную для bnl драйверную линию, bnl-LexA.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Du et al., An Efficient Strategy for Generate Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Генетика мух и скрининг (Рисунок 1 и Рисунок 2)

1. Когда введенные эмбрионы вырастут во взрослых особей, скрещивайте каждую отдельную муху G₀ с балансирными мушками. Выберите подходящий балансир для хромосомы, содержащей целевой аллель.
2. Обезболите потомство F1 от каждого скрещивания G0 на подушечке CO₂ и случайным образом выберите 10-20 самцов под стереомикроскопом. Скрещиваем их по отдельности с самками балансира, как показано на рисунке Рисунок 2.
3. Когда личинки F2 вылупятся, выберите одного отца F1 из каждого скрещивания и извлеките гДНК с использованием протокола подготовки геномной ДНК одной мухи:
   1. Приготовить буфер для экстракции гДНК: 10 мМ Tris-Cl pH 8,2, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ NaCl, хранить при комнатной температуре. Приготовьте стоковый раствор протеиназы К 20 мг/мл и храните в морозильной камере.
   2. Поместите каждую муху в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и промаркируйте пробирку. Хранить в морозильной камере при температуре -80 °C на ночь.
   3. Приготовьте свежий рабочий объем экстракционного буфера гДНК, содержащего конечную концентрацию 200 мкг/мл протеиназы K.
      Примечание: Не используйте старый буфер для этого шага.
   4. Сожмите каждую муху в течение 10–15 с с помощью наконечника для дозатора, содержащего 50 μл буфера для сдавливания, не дозируя жидкость. Выложите оставшийся буфер в пробирку и хорошо перемешайте. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 20–30 минут.
   5. Поместите пробирки в термоблок при температуре 95 °C на 1–2 минуты, чтобы инактивировать протеиназу К.
   6. Вращайте вниз в течение 5 минут при 10 000 x g. Храните препарат при температуре 4 °C для дальнейшего ПЦР-анализа.
4. Используйте тот же метод для получения гДНК от мухи nos-Cas9, которая служит отрицательным контролем. Проведите трехэтапный скрининг на основе ПЦР, чтобы определить правильные "концы" HDR (Рисунок 1, Рисунок 3) с использованием gDNA каждого самца F1 в качестве шаблона⁵. Используйте 1 мкл препарата ДНК в следующей реакционной системе ПЦР: 10 мкл 2x PCR Master Mix с красителем, 1 мкл каждого праймера (10 мкМ), 1 мкл матрицы ДНК и 7 мкл ddH₂O.
5. Как показано на рисунке Рисунок 3A, провести ПЦР с использованием праймеров fwd1 и rev1 для проверки наличия вставки или замены; провести ПЦР с использованием праймеров fwd2 и rev2 для проверки вставки или замены из 3'-области; провести ПЦР с использованием праймеров M13F и rev3 для проверки "ends-in" HDR (Таблица 1C).
6. Сохраняйте нахлыстовые лески с подтвержденным ends-out HDR и устанавливайте сбалансированные запасы с поколения F2. Ауткросс на балансире снова летит, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах.

Результаты

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса редактирования генома, опосредованного CRISPR/Cas9, для создания бинарной системы транскрипции. Указывается примерная продолжительность времени, необходимая для каждого этапа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трис-HCl	Сигма Олдрич	Т3253	молекулярная биология
Эдта	Сигма Олдрич	Е1161	молекулярная биология
NaCl	Сигма Олдрич	С7653	молекулярная биология
Ультрачистая вода, не содержащая ДНКазы/РНКазы	ThermoFisher Scientific	10977-023	молекулярная биология
Грунтовки	IDT-ДНК		ПЦР
Протеиназа К	ThermoFisher Scientific	25530049	молекулярная биология
2x PCR PreMix, с красителем (красный)	Сидлаб	MB067-EQ2R	молекулярная биология
MKRS/TB6B	Лаборатория Корнберга		Нахлыстовая леска
Станция CO2	Дженеси Сайентиал	59-122УКУ	Толкание мух
Стереомикроскоп	Олимп	СЗ-61	Толкание мух
Пестики для гомогенизации в микротрубках	Фишер-Сайентифик	Тел.: 03-421-217	выделение геномной ДНК

(Английский)