Скрининг геномных модификаций: метод идентификации мутантов, сгенерированных CRISPR, у дрозофил

Abstract

Источник: Du, L., et al. Эффективная стратегия генерации тканеспецифичных бинарных транскрипционных систем у дрозофил путем редактирования генома. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает метод скрининга для идентификации трансгенных мух дрозофилы, чей геном был изменен с помощью CRISPR-Cas9. CRISPR-Cas9 — это мощный инструмент редактирования генома, который произвел революцию в том, как ученые могут манипулировать геномом организма. В примере протокола мы увидим, как идентифицировать мутантов, сгенерированных CRISPR, в которых вставка трансактивационной последовательности заменяет первый экзон гена без ветвей (bnl), создавая таким образом ген-специфичную для bnl драйверную линию, bnl-LexA.

Protocol

Этот протокол представляет собой выдержку из Du et al., An Efficient Strategy for Generate Tissue-specific Binary Transcription Systems in Drosophila by Genome Editing, J. Vis. Exp. (2018).

1. Генетика мух и скрининг (Рисунок 1 и Рисунок 2)

1. Когда введенные эмбрионы вырастут во взрослых особей, скрещивайте каждую отдельную муху G₀ с балансирными мушками. Выберите подходящий балансир для хромосомы, содержащей целевой аллель.
2. Обезболите потомство F1 от каждого скрещивания G0 на подушечке CO₂ и случайным образом выберите 10-20 самцов под стереомикроскопом. Скрещиваем их по отдельности с самками балансира, как показано на рисунке Рисунок 2.
3. Когда личинки F2 вылупятся, выберите одного отца F1 из каждого скрещивания и извлеките гДНК с использованием протокола подготовки геномной ДНК одной мухи:
   1. Приготовить буфер для экстракции гДНК: 10 мМ Tris-Cl pH 8,2, 1 мМ ЭДТА, 25 мМ NaCl, хранить при комнатной температуре. Приготовьте стоковый раствор протеиназы К 20 мг/мл и храните в морозильной камере.
   2. Поместите каждую муху в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и промаркируйте пробирку. Хранить в морозильной камере при температуре -80 °C на ночь.
   3. Приготовьте свежий рабочий объем экстракционного буфера гДНК, содержащего конечную концентрацию 200 мкг/мл протеиназы K.
      Примечание: Не используйте старый буфер для этого шага.
   4. Сожмите каждую муху в течение 10–15 с с помощью наконечника для дозатора, содержащего 50 μл буфера для сдавливания, не дозируя жидкость. Выложите оставшийся буфер в пробирку и хорошо перемешайте. Выдерживать при температуре 37 °C в течение 20–30 минут.
   5. Поместите пробирки в термоблок при температуре 95 °C на 1–2 минуты, чтобы инактивировать протеиназу К.
   6. Вращайте вниз в течение 5 минут при 10 000 x g. Храните препарат при температуре 4 °C для дальнейшего ПЦР-анализа.
4. Используйте тот же метод для получения гДНК от мухи nos-Cas9, которая служит отрицательным контролем. Проведите трехэтапный скрининг на основе ПЦР, чтобы определить правильные "концы" HDR (Рисунок 1, Рисунок 3) с использованием gDNA каждого самца F1 в качестве шаблона⁵. Используйте 1 мкл препарата ДНК в следующей реакционной системе ПЦР: 10 мкл 2x PCR Master Mix с красителем, 1 мкл каждого праймера (10 мкМ), 1 мкл матрицы ДНК и 7 мкл ddH₂O.
5. Как показано на рисунке Рисунок 3A, провести ПЦР с использованием праймеров fwd1 и rev1 для проверки наличия вставки или замены; провести ПЦР с использованием праймеров fwd2 и rev2 для проверки вставки или замены из 3'-области; провести ПЦР с использованием праймеров M13F и rev3 для проверки "ends-in" HDR (Таблица 1C).
6. Сохраняйте нахлыстовые лески с подтвержденным ends-out HDR и устанавливайте сбалансированные запасы с поколения F2. Ауткросс на балансире снова летит, чтобы удалить любые непреднамеренные мутации на других хромосомах.

Results

Рисунок 1: Обзор рабочего процесса редактирования генома, опосредованного CRISPR/Cas9, для создания бинарной системы транскрипции. Указывается примерная продолжительность времени, необходимая для каждого этапа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Трис-HCl	Сигма Олдрич	Т3253	молекулярная биология
Эдта	Сигма Олдрич	Е1161	молекулярная биология
NaCl	Сигма Олдрич	С7653	молекулярная биология
Ультрачистая вода, не содержащая ДНКазы/РНКазы	ThermoFisher Scientific	10977-023	молекулярная биология
Грунтовки	IDT-ДНК		ПЦР
Протеиназа К	ThermoFisher Scientific	25530049	молекулярная биология
2x PCR PreMix, с красителем (красный)	Сидлаб	MB067-EQ2R	молекулярная биология
MKRS/TB6B	Лаборатория Корнберга		Нахлыстовая леска
Станция CO2	Дженеси Сайентиал	59-122УКУ	Толкание мух
Стереомикроскоп	Олимп	СЗ-61	Толкание мух
Пестики для гомогенизации в микротрубках	Фишер-Сайентифик	Тел.: 03-421-217	выделение геномной ДНК