Этот протокол является выдержкой из Koon et al., Preparation of Prokaryotic and Eukaryotic Organisms Using Chemical Drying for Morphological Analysis in Scanning Electron Microscopy (SEM), J. Vis. Exp.(2019).
1. Препарирование и фиксация
- Подготовьте Drosophila melanogaster (плодовую муху).
- Обезболите взрослых мух, используя 100% углекислый газ. Поместите взрослых под наркозом (от 10 до 30 мух) в небольшой пластиковый флакон с завинчивающейся крышкой или в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Погрузите обезболенных мух в 1 мл фиксатора (1,25% глутаральдегида, 0,1 М фосфатного буфера pH 7,2) на 2 ч (или на ночь) при 4 °C. Если мухи всплывают на поверхность фиксатора, добавьте несколько капель 2,5% трет-октилфенилового эфира полиэтиленгликоля, чтобы ослабить поверхностное натяжение фиксатора, что приведет к полному погружению ткани. Снимите фиксатор с помощью стеклянной пипетки.
2. Стирка и обезвоживание
- Вымойте и обезвожьте Drosophila melanogaster (плодовую муху).
- Зафиксированный образец трижды промыть 1 мл 0,1 М фосфатного буфера pH 7,2 при комнатной температуре в течение 10 мин в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл. Удаляйте каждую полоску стеклянной пипеткой, стараясь не удалять мух.
- Обезвоживайте образец с использованием сортированного этанола в течение 10 мин в объеме 1 мл в микрофуге-пробирке. Концентрации этанола: 25%, 50%, 75%, 80%, 95%, 100%. Удалите этанол стеклянной пипеткой, стараясь не удалить мух.
- Храните образец в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл с достаточным количеством 100% этанола, чтобы покрыть образец перед сушкой.
3. Сушка
- Проведите химическую сушку с помощью гексаметилдисилазана (HMDS).
- Замените 100% раствор этанола раствором HMDS и 100% этанолом в соотношении 1:2 на 20 мин. Замените раствор 1:2 раствором HMDS и 100% этанолом в соотношении 2:1 на 20 мин. Замените раствор 2:1 на 100% HMDS на 20 мин. Повторите один раз.
Примечание: HMDS является легковоспламеняющимся и острым токсином (кожный путь). С HMDS следует обращаться в вытяжном шкафу с химическими веществами с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты, включая перчатки, лабораторный халат и средства защиты глаз.
- Перенесите образец в HMDS, если он находится в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл, в одноразовую алюминиевую чашку для взвешивания. Оказавшись в алюминиевой чашке для взвешивания, замените 100% HMDS на достаточное количество свежих 100% HMDS, чтобы покрыть образец.
- Перенесите образец в пластиковый или стеклянный невакуумный эксикатор со свежим влагопоглотителем (глубиной 5-6 см) и поместите в вытяжной шкаф для химикатов. В качестве альтернативы поместите образец непосредственно в вытяжной шкаф для химикатов для сушки с неплотной крышкой, например, коробкой, чтобы предотвратить попадание мусора на образец. Дайте образцу высохнуть в течение 12–24 часов.
4. Монтаж
- Гора дрозофила меланогастер (плодовая муха).
- Нанесите маркировку на нижнюю часть алюминиевой монтажной заглушки, чтобы указать, что размещается сверху.
Поместите высушенных мушек в нужное положение на клей или угольный клей, закрепленный на верхней части огрызка, под прецизионным микроскопом с прецизионным пинцетом.
- Нанесите серебряный проводящий клей, т.е. серебряную краску, по внешним краям заглушек. Соедините серебристую краску с мухами с помощью зубочистки, чтобы обеспечить проводимость. Не допускайте, чтобы краска касалась нужной области изображения.
- Поместите заглушки в коробку для держателя заглушек и поместите открытую коробку для держателя заглушек в осушитель. Дайте серебряной краске высохнуть не менее 3 часов или в течение ночи для достижения наилучших результатов.
