Этот протокол представляет собой выдержку из Sunderhaus and Kretzschmar, Mass Histology to Quantify Neurodegeneration in Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Фиксация головы на воротниках и заделка в парафин
ПРИМЕЧАНИЕ: Все шаги в процессе фиксации должны выполняться в вытяжном шкафу. Метилбензоат, хотя и не представляет опасности для здоровья, имеет очень характерный запах, который может быть ошеломляющим, если его не обрабатывать в вытяжном шкафу.
- Перед обезболиванием мух приготовьте 50 мл раствора Карноя, добавив 15 мл хлороформа и 5 мл ледяной уксусной кислоты к 30 мл 99% этанола (не смешивайте хлороформ и уксусную кислоту). Налейте его в стеклянную емкость с плоским дном, например, в чашку для кристаллизации, чтобы воротники могли лежать ровно и были полностью покрыты раствором.
- Обезболите мух CO2 или эфиром.
- Нитки летят (до 20 с большинством ошейников) за шею в ошейники с помощью щипцов. Не забудьте выровнять все головы в одной и той же ориентации, как показано на рисунке Рисунок 1A, и будьте осторожны, чтобы не повредить голову или глаза.
- Включите sine oculis мух (стрелки, Рисунок 1A) в случайные позиции, чтобы можно было легко определить порядок мух в разделах. Кроме того, если экспериментальные мухи имеют светлый или белый цвет глаз, проденьте между ними несколько красноглазых мух, таких как дикий тип, чтобы убедиться в наличии достаточного количества пигмента для окрашивания предметного стекла. Запишите порядок полетов мух на листе протокола вместе с номером ошейника, если используете более одного ошейника.
- После того, как ошейник будет готов, поместите его в приготовленный раствор Carnoy на 3,5 - 4 часа.
- Вылейте раствор Carnoy в соответствующую канистру для утилизации и начните промывку этанолом. Обязательно наливайте медленно, чтобы не нарушить размещение буртов в контейнере.
- Постирайте воротники в течение 30 минут в 99% этаноле дважды.
- Стирайте ошейники в 100% этаноле в течение 1 ч. Обязательно вовремя меняйте стирки, чтобы не допустить переувлажнения.
- Поместите манжеты в метилбензоат O/N в RT. Закройте контейнер парапленкой, чтобы предотвратить испарение метилбензоата.
- Налейте метилбенозат в соответствующую одноразовую емкость в вытяжном шкафу. Добавьте в заранее приготовленную смесь из парафина с низкой температурой плавления 1:1 (56 - 57 °C) и метилбензоата. С этого момента ошейники необходимо хранить в инкубаторе при температуре 65 °C, чтобы парафин не затвердел.
- Вылейте смесь метилбенозата и парафина в подходящий одноразовый контейнер и налейте на кольца расплавленный чистый парафин, хранящийся при температуре 65 °C.
- Смените парафин через 30 минут и повторите это не менее 5 раз. Следует выполнить не менее 6 - 8 стирок.
- После того, как стирка будет завершена, поместите ошейники в резиновый лоток для кубиков льда с прорезями примерно такого размера, как ошейники. Полейте их расплавленным парафином до полного покрытия и дайте ему застыть O/N (старайтесь избегать пузырьков воздуха).
- Снимите парафиновые блоки, содержащие кольца, с лотка для кубиков льда. Отделите парафиновый брусок от воротника с помощью лезвия бритвы, аккуратно отломив воротник. Головы будут находиться в парафиновом блоке, а тела останутся в ошейнике. Блоки можно хранить при комнатной температуре.
- Чтобы очистить ошейники, замочите их в депарафинизирующем средстве при температуре 65 °C, чтобы удалить парафин, очистите его легкой щеткой и промойте в этаноле перед повторным использованием.
