Инъекция взрослой мухи дрозофилы: метод доставки соединения или этикетки

Аннотация

Источник: Nazario-Toole, A. E., Wu, L. P. Оценка клеточного иммунного ответа плодовой мушки, Drosophila melanogaster, с использованием анализа на фагоцитоз in vivo. J. Vis. Exp. (2019).

Это видео описывает, как выполнить инъекцию живых взрослых мух, и включает пример протокола, в котором меченые частицы и трипановый синий вводятся в брюшную полость мухи для анализа фагоцитоза.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Nazario-Toole and Wu, Assessing the Cellular Immune Response of the Fruit Fly, Drosophila melanogaster, Using an in vivo Phagocytosis Assay, J. Vis. Exp. (2019).

1. Подготовка частиц флуоресцеина для инъекций

1. Восстановите 10 мг коммерчески доступных, убитых теплом бактериальных частиц, меченных флуоресцеином (см. Таблицу материалов), до исходной концентрации 10 мг/мл путем добавления 990 мкл стерильного 1x PBS и 10 мкл 50 мМ азида натрия. Вихрь перемешать.
   1. Разделите на одноразовые 8 мкл аликвот в пробирках объемом 0,2 мл и храните в темной коробке при температуре 4 °C><, чтобы свести к минимуму светочувствительность. ПРИМЕЧАНИЕ: Консервант азид натрия не является обязательным и может быть исключен, если запасы 10 мг/мл изготовлены из 1 мл стерильного 1x PBS, аликвотированы, и хранятся при температуре -20 °C.
2. Приготовьте 10 мл раствора 5% пищевого красителя в 1x PBS, смешав 500 мкл шприца, отфильтрованного зеленым пищевым красителем, и 9,5 мл стерильного 1x PBS.
3. Промойте частицы перед инъекцией, чтобы удалить азид натрия. Смешайте 42 мкл стерильного 1x PBS и 8 мкл 10 мг/мл в пробирке объемом 1,7 мл. Центрифуга на максимальной скорости в течение 2,5 мин при комнатной температуре.
   1. Удалите надосадочную жидкость, добавьте 50 μл 1x PBS и центрифугируйте на максимальной скорости в течение 2,5 минут при комнатной температуре.
   2. Повторите шаги 1.3 и 1.3.1 2 раза, всего 3 стирки.
   3. После окончательной промывки выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте частицы до 1,6 мг/мл в 50 мкл 5% пищевого красителя в 1x PBS.
   4. Оберните трубку алюминиевой фольгой для защиты от света. Хранить при температуре 4 °C, выбросить через 1 неделю.

2. Подготавливаем станцию впрыска и полеты

1. Подготовьте инъекционную прокладку. Чтобы ввести до 4 генотипов мух одновременно, с помощью лабораторной ленты разделите прямоугольную площадку для мух CO₂ на 4 секции. На скамейке рядом с микроскопом обозначьте места для размещения флаконов после того, как мухи выстроятся на подушечке (по одной на каждый угол подушечки).
2. Подготовьте флаконы соответствующего возраста, возрастом 4-7 дней, мух для инъекций. Для каждого тестируемого штамма пересадите 5 самцов и 5 самок в свежий флакон с готовым кормом для мух с маркировкой и храните при температуре 25 °C.
3. Подготовьте пневматический инжектор (см. Таблицу материалов), установив прибор в режим 100 мс (короткие всплески давления газа для вытеснения жидкости, позволяющие подавать субнанолитровые объемы).
4. Подготовьте предметные стекла для микроскопа. Отрежьте полоски изоленты диаметром 1,5 дюйма, согните в петлю клейкой стороной наружу и положите на предметное стекло микроскопа с этикеткой.

3. Подготовьте стеклянные капиллярные иглы

1. Вытяните стеклянные иглы (тонкостенные стеклянные капилляры) с помощью иглосъемника.
   1. Подержите иглу под микроскопом с микрометром и сломайте кончик пинцетом из нержавеющей стали #5. Наконечников размером 100 мкм достаточно, чтобы проколоть кутикулу мухи, минимизируя при этом нанесение ран.
   2. Измерьте объем жидкости, который будет введен в каждую муху. Загрузите иглу стерильным 5% пищевым красителем в 1x PBS и выдавите жидкость на каплю минерального масла на ступенчатом микрометре 0,01 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если капля жидкости имеет сферическую форму, то объем в пиколитрах рассчитывается как (размер)³/1910. Игла диаметром 100 мкм выбрасывает ~2 нл за 100 мс.

4. Впрыскивание мух

1. Нанесите пипеткой 10 мкл частиц 1,6 мг/мл на небольшой квадрат парапленки.
   1. Втяните жидкость в иглу и установите форсунку инжектора (см. Таблицу материалов).
   2. Обезболите мух с CO₂ и выстройте их в отведенном для этого месте на подушечке, подфюзеляжной стороной вверх и головой, направленной к передней части подушечки. Поместите флаконы в соответствующие места на столе.
   3. Впрыскивание мушек в верхний угол живота с помощью 5 100 мс насосов жидкости (всего ~10 нл).
   4. Переложите введенных мух в соответствующие флаконы, отметьте время на флаконе. Хранить при температуре 25 °C.
2. Загрузите новую иглу с 0,4% раствором трипанового синего цвета.
3. Установите пневматический инжектор в положение GATED, что обеспечивает постоянный поток воздуха для выталкивания жидкости из иглы.
4. Обезболивайте мух после того, как они отдохнут в течение 30 минут, и вводите Trypan Blue до тех пор, пока брюшная полость не станет полной и раздутой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При исследовании созревания фагосом частицами, помеченными pH-чувствительным красителем, дайте мухам отдохнуть в течение 1 ч и не вводите трипановый синий перед посадкой мух.
5. Крепление мушек на предметных стеклах микроскопа с помощью изоленты подфюзеляжной стороной вниз. Сдвиньте крылья в сторону ширинки и закрепите их на ленте. Также аккуратно вдавливайте головку в ленту, чтобы мушка не сдвинулась с места.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
5430-10 PicoNozzle Kit	World Precision Instruments	5430-10	Держатель для пипетки 1,0 мм
E. coli (штамм K-12) Биочастицы, конъюгат флуоресцеина	Invitrogen	E2861	Убит кишечная палочка, помеченная FITC (флуоресцеином). Используйте для проверки распознавания фагоцитов и поглощения грамотрицательных бактерий. (~494/~518 нм)
Игольчатый пипетка	Инструменты Дэвида Копфа	Модель 725
Пневматический пиконасос PV820	World Precision Instruments	SYS-PV820	Пневматический PicoPump PV820 компании World Precision Instruments использует перепад давления для удержания жидкости в стеклянной игле между инъекциями. Пользователь вручную контролирует короткие всплески давления газа для вытеснения жидкости, что позволяет выдавать субнанолитровые объемы. Количество подаваемой жидкости зависит от двух основных переменных – размера отверстия стеклянной иглы и количества времени, в течение которого применяется давление впрыска. установите прибор в режим "TIMED" со временем 100 мс.
Тонкостенные стеклянные капилляры	World Precision Instruments	TW100F-3	Иглы для инъекций. OD = 1,0 мм
Трипановый синий раствор (0.4%)	Сигма	T8154	Используется для гашения внеклеточной флуоресценции частиц, помеченных флуоресцеином, Alexa Fluor или Texas Red.