$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Bantel and Tessier, Taste Preference Assay for Adult Drosophila, J. Vis. Exp. (2016).
1. Голод
- Приготовьте флаконы для голодания мух, пропитав ватный тампон водой с концентрацией 18,2 МОм на дне стандартного флакона от мух. В качестве альтернативы аналогичным образом пропитайте небольшую полоску фильтровальной бумаги водой с углом 18,2 МОм и поместите под углом внутрь флакона.
- Соберите мух в наборы по ~100 животных на подушечке CO2, а затем добавьте мух в подготовленный флакон.
ПРИМЕЧАНИЕ: Наилучшие результаты достигаются с животными в возрасте менее 5 дней. Тем не менее, точный возраст животных можно контролировать в качестве экспериментальной переменной для определения изменений вкусовых предпочтений с течением времени.
- Используйте ватный тампон или поролоновую пробку, чтобы зафиксировать флаконы закрытыми. Поместите флаконы на бок в инкубатор с контролируемой окружающей средой. Поддерживайте температуру на уровне 25 °C, а влажность выше 70%. Оставьте флаконы нетронутыми на 24 часа.
2. Анализ вкусовых предпочтений
- Подготовьте все тесты к анализу в тот же день, что и тестирование.
ПРИМЕЧАНИЕ: Точные вкусовые добавки, которые будут использоваться, будут варьироваться в зависимости от задаваемого экспериментального вопроса. Ниже приведены примеры дегустаций, используемых в этом протоколе. Оптимизации см. в разделе 4.
- Приготовьте контрольный тастант (1 мМ сахарозы), смешав 10 мкл 100 мМ раствора сахарозы, 13 мкл красного пищевого красителя и 977 мкл 18,2 МОм воды.
- Приготовьте экспериментальный тастант (5 мМ сахарозы), смешав 50 мкл 100 мл раствора сахарозы, 10 мкл синего пищевого красителя и 940 мкл 18,2 МОм воды.
- Пробирные камеры изготавливают с помощью стандартной пластиковой чашки Петри размером 100 мм х 15 мм, приготовленной следующим образом:
- Поместите три капли по 10 мкл контрольной тастаны ближе всего к краю пластины в положении «12 часов» и еще 3 капли в положении «6 часов». Убедитесь, что расстояние между каплями одинаково.
- Поместите три капли по 10 мкл экспериментального тастанта ближе всего к краю пластины в положении «3 часа» и еще 3 капли в положении «9 часов». Убедитесь, что расстояние между каплями одинаково.
- Повторите шаги 2.2.1 и 2.2.2 для необходимого количества повторений.
- Опустошите 1 флакон из ~100 голодных мух на подушечку сCO2 ровно настолько, чтобы обезболить всех животных (примерно 10 секунд). Выложите животных щеткой в середину подготовленной пробирной камеры и накройте крышкой посуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Следует избегать более длительных периодов воздействияCO2, чтобы ускорить время восстановления и ограничить вмешательство в пищевое поведение. Воздействие льда (~5 минут) может быть использовано для обезболивания, чтобы избежать поведенческих эффектов CO2, которые могут возникнуть даже при ограниченном воздействии.
- Поместите пробирную камеру в непрозрачную картонную коробку. Обязательно пометьте внешнюю сторону коробки с указанием состояния и тестируемого генотипа.
- Поместите всю установку (пробирную камеру в картонную коробку из шага 2.4) в инкубатор с температурой 25 °C и влажностью не менее 70% на 2 часа.
- Повторите шаги с 2.3 по 2.5 для всех реплик.
- Через 2 часа поместите пробирные камеры, все еще находящиеся в картонных коробках, непосредственно в морозильную камеру при температуре -20 °C до тех пор, пока они не будут готовы к количественному измерению.
3. Количественная оценка вкусовых предпочтений
- Дайте одной пробирной камере прогреться до комнатной температуры (примерно 5 минут).
- Под микроскопом для вскрытия, используя кисть или пару щипцов, группируют животных по цвету их брюшка: красный, синий, фиолетовый или прозрачный (Рисунок 1).
- Запишите количество животных в каждой группе. Считайте явных животных не участвовавшими в анализе и поэтому не включайте их ни в какие расчеты.
- Рассчитайте индекс предпочтения по одной из следующих формул:
- Если к красному красителю добавить интересующее экспериментальное вещество, то используйте (Nкрасный + 0,5Nфиолетовый)/(Nкрасный + Nсиний + Nфиолетовый).
- Если к синему красителю добавить экспериментальный оттенок, то скорректируйте уравнение следующим образом: (Nсиний + 0,5Nфиолетовый)/(Nсиний + Nкрасный + Nфиолетовый).
- Повторите расчеты для всех экспериментальных условий и повторите.
4. Оптимизация анализа вкусовых предпочтений
- Опытным путем определить концентрацию показателей пищевого красителя, которые будут использоваться, чтобы пищевой краситель не повлиял на исход вкусовой пробы, следующим образом:
- Приготовьте 4 вкуса, используя одно и то же базовое соединение (например, 5 мМ сахарозы), как указано в шаге 2.1, но не добавляйте пищевой краситель.
- Добавьте 1,3% красного пищевого красителя в один из вкусов. Сделайте оставшиеся 3 вкуса с синим пищевым красителем разной концентрации в каждой пробирке (например, 0,6%, 1% и 1,3%).
- Выполните шаги протокола с 2.2 по 3.4 для каждой пары: 1,3% красного против 0,6% синего; 1,3% красного против 1% синего и 1,3% красного против 1,3% синего.
- Повторяйте шаги 4.1.1-4.1.3 с разным процентным содержанием синего пищевого красителя до тех пор, пока индекс предпочтений не достигнет среднего значения 0 (Рисунок 2).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве отправной точки, 1,3% красного пищевого красителя в сочетании с 1% синего пищевого красителя обычно дают хорошие результаты. Если удовлетворительная концентрация синего пищевого красителя не может быть сопоставлена с 1,3% красителя, то шаги с 4.1.1 по 4.1.3 можно повторить с различными концентрациями красного красителя и постоянной концентрацией синего пищевого красителя.
- Анализируйте все тестируемые условия с одинаковыми оптимизированными концентрациями пищевых красителей.
