Анализ CApillary FEeder (CAFE): метод отслеживания потребления и предпочтений пищи у дрозофил

Аннотация

Источник: Diegelmann, S., et al. Анализ CApillary FEeder измеряет потребление пищи у Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

В этом видео описывается анализ CApillary FEeder, или CAFE, поведенческий метод, который измеряет потребление пищи и предпочтения необузданных плодовых мушек. Представленный протокол показывает, как выполнить анализ с минимальным испарением из заполненных жидкостью капилляров, используемых для доставки пищи, и отслеживать ее потребление.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Diegelmann et al., The CApillary FEeder Assay Measures Food Intake in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

1. Сборка и проведение анализа CApillary FEeder

1. Если голодание не требуется, переведите опытных мух на пробу простукиванием или продувкой. Убедитесь, что в комплект входят три контрольных флакона без мух, чтобы количественно оценить испарение.
2. Осторожно извлеките наконечник пипетки (объемом 2–20 мкл), закрывающий одно из внешних отверстий, и вставьте заполненный стеклянный капилляр нижним концом вперед. Закрепите капилляр, поместив наконечник пипетки обратно рядом с капилляром. Если тестируется несколько пищевых растворов, повторите эту процедуру соответственно.
3. Поместите концы капилляров внутрь всех флаконов на одном уровне, чтобы избежать смещения, которое могло бы произойти, если бы источники пищи располагались на разной высоте (3 - 4 см от крышки); соблюдайте расстояние до фильтровальной бумаги, чтобы предотвратить утечку капилляра при случайном касании фильтровальной бумаги или источников пищи разной вязкости.
4. Пометьте маркером верхний конец цветной жидкости (отметьте_начало). Чтобы обеспечить идентификацию различных капилляров, пометьте их по отдельности с помощью кода цвета или полосы.
5. Поместите несколько подготовленных тестов CAFE в пластиковую коробку с сетчатой вставкой и перенесите коробку (Рисунок 2A) в безопасное место в лабораторных условиях или в климатической камере с контролируемой температурой, светом и влажностью (параметры: 25 °C, относительная влажность 60%, цикл свет-темнота 12 ч/12 ч) на экспериментальный период (например, 3 ч или дней).
6. По мере высыхания нижней фильтровальной бумаги, если анализ проводится в течение нескольких дней, подавайте свежую воду каждые 24 часа через губчатый рукав (100 μл), чтобы поддерживать постоянную влажность внутри анализа. Используйте четыре отдельных флакона (высотой 8 см, диаметром 3,3 см), наполненными 30 мл ddH₂O, в качестве устройств для измерения влажности и поместите их рядом с тестами CAFE в пластиковой коробке. Используйте крышку для пластикового ящика, чтобы создать среду с контролируемой влажностью во время эксперимента (Рисунок 2A).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более широкая вариабельность наблюдается в лабораторных условиях; тем не менее, анализ CAFE можно проводить при комнатной температуре (например, в классе). Настоятельно рекомендуется использовать увлажняющее устройство (фильтровальная бумага, с мокрой губкой или без нее, наполненные флаконы с водой и крышка для пластиковой коробки) для уменьшения испарения (Рисунок 2B).
7. Заменяйте капилляры свеженаполненными для длительных экспериментов каждые 24 часа. Записывайте мертвых мух перед каждым 24-часовым интервалом и используйте количество живых мух для расчета потребления на одну муху в течение следующего периода. Откажитесь от старых капилляров после измерения спада мениска (см. 2.1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время 3-часового эксперимента мы почти не видим мертвых мух. В течение 4-дневного исследования мы обычно находим 1 - 3 мертвых мухи.
8. В конце анализа или перед заменой капилляра отметьте маркером нижний мениск капилляра (_конец метки), пока тест CAFE все еще находится в вертикальном положении. Отбрасывайте данные, если_конец метки не находится ниже начальной отметки (_начала марки). Не снимайте крышку, так как это может привести к изменению мениска.
9. Аккуратно извлеките капилляры из анализа и сохраните их для сбора данных. Проверьте, достигла ли жидкость внутри капилляра нижнего конца, если не отбросить данные, так как пища была недоступна для мух. Соберите все капилляры по флакону группой. Вставьте необрезанные наконечники пипеток во все отверстия, чтобы предотвратить побег мух. Демонтируйте установку и промойте флаконы, крышки и губки в мыльной бане и высушите в течение ночи при комнатной температуре для дальнейшего использования><. ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи могут быть дополнительно проанализированы после проведения анализа. Подтвердите усвоение пищи на глаз или под микроскопом вскрытия.
10. Повторите эксперименты с одними и теми же генотипами по крайней мере в три разных дня.

2. Сбор и анализ данных

1. Измерьте расстояние между_{началом} и_концом метки на капилляре с помощью штангенциркуля или линейки. Чтобы передать данные непосредственно в электронную таблицу, используйте цифровой суппорт, подключенный к USB (Universal Serial Bus) (Рисунок 1E). После измерения выбросьте капилляры.
2. Учитывайте размер капилляров для расчета поглощения или испарения пищи. Например, рассмотрим капилляр длиной 73 мм, содержащий 5 мкл пищевого раствора. Уменьшение мениска на 14,6 мм отражает поглощение раствора в объеме 1 мкл. Рассчитайте потребление пищи по следующей формуле:
   Поглощение пищи (μл) = измеренное расстояние (мм)/ 14,6 мм
3. Чтобы исключить влияние испарения на потребление пищи, рассчитайте среднее испарение в трех (как минимум) контрольных флаконах без мух. Вычтите это среднее значение из значения, полученного за потребление пищи мухами.
4. Используйте следующую формулу для определения общего потребления на муху:
   Расход пищи (μл) = (Поглощение пищи [μл] - Потери на испарение [μл])/общее количество мух во флаконе. Для длительных экспериментов используют количество живых мух до начала 24-часового интервала.
5. Чтобы учесть различия в размерах тела, например, между самцами и самками мух, нормализуйте потребление пищи в соответствии с массой тела (μL пищи/мг мухи).
6. Используйте статистическое программное обеспечение для анализа данных. Для нормально распределенных данных используйте Т-критерий Стьюдента для определения различий между двумя группами мух и используйте ANOVA (анализ дисперсии) с апостериорными тестами Тьюки Крамера для более чем двух групп. В ситуации выбора проанализируйте отличия от случайного выбора с помощью непараметрического теста на один знак выборки.

Результаты

Рисунок 1: Анализ Drosophila melanogaster CApillary FEeder. А) Анализ питания мухами. Увлажненная фильтровальная бумага обеспечивает попадание воды на дно флакона. В ходе эксперимента предусмотрено четыре капилляра (пища красного и синего цвета в противоположных капиллярах). Обратите внимание, что капилляры фиксируются на месте вторым наконечником для пипетки, а неиспользуемые позиции закрываютс...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Флаконы (размножение)	Greiner Bio-One	960177	www.greinerbioone.com
Флаконы (анализ CAFE)	Greiner Bio-One	217101	www.greinerbioone.com
Пробирный анализ Lid-CAFE	мастерская	–	–
Пластиковый ящик, низкая стенка	Приятное времяпрепровождение	353	www.plastime.it
Крышка для пластикового ящика	мастерская	–	–
Капилляров	БЛАУБРАНД	REF 7087 07	www.brand.de
Наконечники для пипеток	Greiner Bio-One	771290 (Английский	www.greinerbioone.com
Круги из фильтровальной бумаги	ватман	10 311 804	www.sigmaaldrich.com
D(+)-сахароза	АпплиХим	57-50-1 (Английский	www.applichem.com
Абсолют этанола	VWR Химикаты	20 821 330	www.vwr.com
Пищевой краситель (красный, Е124)	Бэкфан	10027	www.backfun.de
Пищевой краситель (синий, Е133)	Бэкфан	10030	www.backfun.de
Мыльный раствор (CVK 8)	КВГ	No 103220 (Английский	www.cvh.de
Цифровой штангенциркуль	ГАРАНТ	412 616	www.hoffmann-group.com
Флаконы (размножение)			Высота 9,8 см, диаметр 4,8 см
Флаконы (анализ CAFE)			Высота 8 см, диаметр 3,3 см
Пробирный анализ Lid-CAFE			Изготовлено в университетской мастерской, технический чертеж прилагается Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Пластиковый ящик, низкая стенка			Пластиковая сетчатая вкладыш была изготовлена на заказ для расположения флаконов 8 x 10
Крышка для пластикового ящика			Размеры (37 x 29 x 18 см)
Капилляров			Стандарт DIN ISO 7550, IVD-директива 98/79 EG, торцы полированные
Наконечники для пипеток			Пипетки для внешнего круга нарезаются по крышке
Круги из фильтровальной бумаги			Диаметр 45 мм хорошо работает, если сложить его для используемых флаконов
D(+)-сахароза			Не вреден
Абсолют этанола			Легковоспламеняющиеся жидкости и пары
Пищевой краситель (красный, Е124)			Не указано
Пищевой краситель (синий, Е133)			Не указано
Мыльный раствор (CVK 8)			Мыло с нейтральным запахом
Цифровой штангенциркуль
Стандартный корм для мух			(для 20 л)
агар			160 г
Пивные дрожжи			299,33 г
Кукурузной муки			1 200 г
патока			1.6 л
Пропионовая кислота			57,3 мл
Нипагин 30%			160 мл

шт. ) ) )