Этот протокол представляет собой выдержку из Tenenbaum and Gavis, Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells, J. Vis. Exp.(2016).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура удаления мышц (Рисунок 1) является модификацией ранее описанных методов подготовки филе личинок. Шаги, которые предшествуют и следуют за удалением мышц, кратко очерчены, и читатель отсылается к предыдущей работе в Brent, et al., J. Vis. Exp. (2009) и Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011) для более подробного описания.
1. Препарировать личинку в холодном солевом растворе
- Приготовьте рабочий раствор из холодного солевого раствора HL3.1 или холодного безвредного Ca2+ физиологического раствора HL3.1 (табл. 1). Поместите личинку в форму из силиконового эластомера с достаточным количеством холодного солевого раствора, чтобы покрыть дно посуды.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы рекомендуем экспериментировать с использованием безвредного для Ca2+ физиологического раствора HL3.1 по сравнению со стандартным физиологическим раствором HL3.1 во время вскрытия личинок. При недостатке кальция сокращения личиночных мышц сильно снижаются. Таким образом, филе личинок может быть легче манипулировать при препарировании в физрастворе HL3.1, не содержащем Ca2+. Тем не менее, мы обнаружили, что сокращение мышц создает пространство между мышцей и эпидермисом, и это может облегчить введение щипцов между этими тканями, сводя к минимуму риск повреждения эпидермиса. В результате, стандартный HL3.1 может быть предпочтительным для сохранения целостности эпидермиса и da нейронов. Мы получаем хорошие результаты при использовании любого физиологического раствора, и выбор остается за пользователем.
- Расположите личинку брюшной стороной вверх. Вентральная поверхность личинки может быть идентифицирована по брюшным зубным поясам, а дорсальная сторона — по первичным личиночным трахеальным трубкам, идущим от передней к задней. Растяните личинку в передне-заднем направлении и приколите голову и хвост к силиконовой эластомерной тарелке для препарирования с помощью булавок от насекомых. С помощью тонких ножниц для рассечения разрежьте вдоль вентральной средней линии, начиная с одного конца и продвигаясь к другому.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта ориентация сохраняет обычно изучаемый дорсальный кластер нейронов da.
- После того, как личинка будет разрезана, приколите четыре угла к тарелке для препарирования, как будто открывая книгу. С помощью щипцов захватывайте и удаляйте внутренние органы, включая ЦНС, кишечник и трахею. Отрегулируйте булавки для насекомых так, чтобы скругление было натянутым, но не максимально растянутым.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышцы прикреплены к стенке тела на сегментарных границах. Хотя мышцы покрывают большую часть стенки тела, они отсутствуют в узкой области вблизи дорсальной средней линии.
2. Удаление мышц
- Расположите дорсальную среднюю линию личинки, где отсутствует мышечная ткань. Расположите один зубец щипцов таким образом, чтобы его можно было ввести под мышечную ткань в максимально плоской ориентации.
- Начиная с дорсальной средней линии, рядом с передней границей сегмента, осторожно проведите зубцы щипцов между мышцей и эпидермисом, стараясь свести к минимуму контакт между щипцами и эпидермисом.
- Потяните щипцы вверх, чтобы разорвать прикрепление мышцы к стенке тела в одной опорной точке. Повторите этот процесс для остальныхся интересующих полусегментов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол оптимизирует сохранение задней части каждого дендритного поля каждого нейрона. Чтобы сохранить переднюю часть дендритного поля, лучше всего вставлять зубцы щипцов на задний конец каждого сегмента.
- Отрегулируйте булавки насекомых таким образом, чтобы филе личинок было максимально растянуто во все стороны.
- Закрепите филе, пока оно еще прикреплено, к препарирующей чашке с помощью холодного, свежеприготовленного 4% формальдегида в PBS в течение 25 минут.
- Прополоскать 5 раз в PBS.
- С помощью щипцов осторожно оттяните мышечную ткань от оставшихся опорных точек, стараясь свести к минимуму контакт с эпидермисом.
- Открепите и выньте филе из чашки для препарирования в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Выполните все последующие этапы промывания, блокирования и иммунофлуоресцентного окрашивания, как описано ранее в Karim and Moore, J. Vis. Exp. (2011).
