Этот протокол является выдержкой из Reimels and Pfleger, Methods to Examination the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2016).
1. Иммуногистохимия лимфатических желез личинок
ПРИМЕЧАНИЕ: Лимфатическая железа расположена примерно на одну треть длины от переднего конца личинки немного ниже мозга на дорсальной стороне. (См. стрелку в Рисунок 1B.) Лимфатическая железа фланкирует дорсальный сосуд и легче всего рассекается, прикрепляясь к ротовым крючкам или к мозгу. Лимфатические узлы дикого типа, третьего возраста, представляют собой очень мелкие структуры; Первичные доли имеют длину примерно 100 - 200 мкм. (См. Рисунок 2A.)
- Чтобы получить личинки примерно одинаковой стадии развития для этого анализа, ограничьте сбор яиц, позволив самкам откладывать яйца в течение фиксированного периода времени от 2 до 6 часов.
- Диссекция лимфатических желез
- Для каждого экспериментального условия добавьте 1 мл 1x PBS (Таблица 1) в одну лунку 24-луночного планшета.
- Добавьте 1 каплю 0,1% PBST (Таблица 1) в каждую лунку с помощью одноразовой передаточной пипетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Моющее средство, такое как Tween 20, добавляется для снижения поверхностного натяжения, что позволяет ткани опуститься на дно колодца.
- Поставьте тарелку на лед.
- Соберите личинок в лунки для препарирования, наполненные 1x PBS.
- Положите чистую препарирующую прокладку на подсвеченное основание стереомикроскопа. С помощью одноразовой переводной пипетки нанесите небольшие капли 0,01% PBST (Таблица 1) на подушечку. Перенесите одну личинку в каплю PBST для вскрытия.
- Держите личинку одной парой щипцов примерно на четверть длины от заднего конца, тыльной стороной вверх.
- Используйте еще одну пару щипцов, чтобы захватить кутикулу непосредственно перед щипцами, которые удерживают личинку. Осторожно потяните кутикулу к переднему концу, пока не обнажаются крючки для рта.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы отшелушить кутикулу, не нарушая никаких внутренних структур.
- Освободите кутикулу и с помощью обоих щипцов разрежьте личинку на две части. Снимите задний конец с капли PBST.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если кутикула не отслаивается до всех ротовых крючков, разрежьте личинку надвое и удалите задний конец. Используйте одну пару щипцов, чтобы удерживать край кутикулы, а другую пару щипцов используйте для проталкивания крючков для рта через отверстие. Это вывернет кутикулу и обнажит крючки для рта. Это также может быть использовано в качестве альтернативного метода диссекции.
- Используйте одну пару щипцов, чтобы прикрепить кутикулу (либо вентральную кутикулу, либо лоскут тыльной стороны кутикулы, либо и то, и другое) для устойчивости.
- С помощью другой пары щипцов возьмите обнаженные крючки для рта и осторожно вытащите их.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это отделит кутикулу от внутренних структур. В идеале, имагинальные диски глаза/антенны, мозг, кольцевая железа и лимфатическая железа, прилегающие к дорсальному сосуду, должны оставаться прикрепленными к ротовым крючкам.
- Все еще удерживая крючки для рта, осторожно удалите нежелательные структуры, такие как слюнные железы, жировое тело и кишечник.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если мозг отделяется от ротовых крючков, лимфатическая железа все еще может быть прикреплена к мозгу и собрана вместе с ним. В этом случае придерживайте вентральный нервный канатик вместо крючков для рта.
- Используя в качестве ручки крючки для рта или вентральный нервный канатик, перенесите рассеченный комплекс, содержащий лимфатическую железу, в лунку на льду. Не более чем за 30 минут до фиксации.
- Фиксация и иммуногистохимия
- Поместите 24-луночный планшет на основание стереомикроскопа.
- С помощью пипетки p200 осторожно удалите PBST из лунки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Пустые, соседние колодцы полезны для временного складирования отходов.
- Аккуратно добавьте 200 мкл 3,7% формальдегида (Таблица 1) вниз по стенке лунки и покрутите пластину, чтобы убедиться, что рассеченные ткани полностью погружены в воду.
- Верните тарелку в лед на 30 минут. Если лимфатические узлы экспрессируют флуоресцентные белки, держите пластину закрытой, чтобы предотвратить фотообесцвечивание.
- С помощью пипетки p200 осторожно снимите фиксатор.
- Промойте, добавив в лунку 200 μл 1x PBS и поместив пластину на орбитальный шейкер на 5 минут при комнатной температуре. С помощью пипетки p200 осторожно удалите PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Неподвижные лимфатические узлы можно оставить на льду в PBS до тех пор, пока лимфатические узлы для всех экспериментальных условий не будут препарированы и зафиксированы.
- Повторите шаги стирки еще два раза.
- Добавьте в лунку 200 мкл раствора для пермеабилизации (табл. 1). Установите пластину на орбитальный шейкер на 45 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: 45 минут - это "золотой стандарт" для пермеабилизации лимфатических желез, но авторы добиваются успеха уже через 20 минут.
- Удалите раствор с помощью пипетки p200.
- Развести первичное антитело раствором антитела (Таблица 1) в соответствии со спецификациями поставщика. Добавьте в лунку 300 мкл первичного раствора антитела и убедитесь, что рассеченные ткани полностью погружены в воду. Инкубировать при температуре 4 °C в течение ночи.
- Используйте пипетку p200 для удаления первичного антитела.
- Промойте, добавив в лунку 200 μл 1x PBS и поместив пластину на орбитальный шейкер на 10 минут при комнатной температуре. С помощью пипетки p200 осторожно удалите PBS.
- Повторите шаги стирки еще два раза.
- Развести вторичное антитело раствором антитела в соответствии со спецификациями поставщика. Добавьте в лунку 300 мкл раствора вторичного антитела и убедитесь, что рассеченные ткани полностью погружены в воду. Инкубируйте на орбитальном шейкере не менее 2 часов при RT.
- Используйте пипетку p200 для удаления вторичного антитела и промойте, как описано в шагах 1.3.12 и 1.3.13. Не снимайте PBS после окончательной промывки.
- Монтаж лимфатических желез
- Очистите предметные стекла микроскопа с использованием этанола 70% (Таблица 1) и салфеток.
- Для каждого экспериментального условия поместите одну каплю монтажного буфера (Таблица 1) на предметное стекло.
ПРИМЕЧАНИЕ: На одном слайде умещаются два условия. Объем монтажного буфера зависит от количества монтируемых лимфатических узлов. Используйте 2 мкл примерно для 18–20 лимфатических узлов, 1 мкл для 10–12 и 0,5 мкл для 5 или менее.
- Поместите предметное стекло микроскопа на подсвеченное основание стереомикроскопа.
- При одновременном урегулировании до двух состояний переведите все лимфатические узлы из лунки в монтажный буфер с помощью щипцов, используя в качестве ручки крючки для рта или вентральный нервный канатик.
- Равномерно распределите рассеченные ткани в круглую или прямоугольную форму, распределяя при этом монтажный буфер.
- Для каждой из рассеченных тканей по отдельности проведите по одной щипце щипцов под дорсальный сосуд и осторожно потяните к периферии монтажного буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это вытянет лимфатическую железу из остальных рассеченных тканей и сделает лимфатическую железу плоской на стекле.
- С помощью одного щипца щипцов и пилящими движениями разрежьте дорсальный сосуд между лимфатической железой и мозгом.
- Переместите остальные рассеченные ткани на противоположную сторону лимфатической железы, на самый дальний край буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нежелательные рассеченные ткани со временем образуют периметр вокруг лимфатических узлов и служат опорой, на которую будет опираться покровная ткань.
- Повторяйте до тех пор, пока все лимфатические узлы не будут отделены от рассеченных тканей, оставляя одну из нежелательных рассеченных тканей для размещения в центре.
- Возьмите покровный листок между двумя пальцами. Убедитесь, что на чехле нет пыли и отпечатков пальцев. При необходимости используйте салфетку и 70% этанол для очистки покровного стекла.
- Убедившись, что край покровного стекла параллелен краю предметного стекла, осторожно опустите покровное стекло над монтажным буфером.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед получением изображения предметные стекла микроскопа можно хранить при температуре 4 °C. Максимальное время хранения зависит от стабильности используемых антител. 24-луночные планшеты можно промывать и использовать повторно.
2. Визуализация
- Изображение фиксированных гемоцитов и установленных лимфатических узлов на соответствующем стандартном флуоресцентном или конфокальном микроскопе с увеличением 20X или более в соответствии с инструкцией по эксплуатации производителя. Визуализируйте целые личинки на стандартном стереомикроскопе с 2-кратным увеличением в соответствии с инструкцией по эксплуатации производителя.
- При желании следуйте инструкциям поставщика программного обеспечения по деконволюции.
