Этот протокол является выдержкой из Kelly et al., Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains, J. Vis. Exp. (2017).
1. Подготовка станции вскрытия
- Расположите стереомикроскоп и источник света с прикрепленными оптоволоконными гуськами на большой столешнице. Чтобы обеспечить устойчивые движения рук и уменьшить «дрожание» рук во время препарирования, важно, чтобы вокруг микроскопа было достаточно места для рук и подлокотников. Убедитесь, что расстояние между основанием микроскопа и краем стола составляет примерно 8 - 10 дюймов по обе стороны от микроскопа, а между основанием микроскопа и краем стола - 4 - 6 дюймов.
- Заполните 2 или 3 лунки стеклянной 9-луночной или 3-луночной чашки 1,0 мл буфера PTN (0,1 М буфера фосфата натрия pH 7,2, 0,1% неионогенного поверхностно-активного вещества, см. Таблицу материалов для полных буферных компонентов) и поместите рядом со станцией препарирования на лед. Только что препарированный мозг будет перенесен в эту чашку и храниться до этапа фиксации.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется визуализация в реальном времени, буфер для диссекции должен быть 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) или буфер HL3. Если требуется внутриклеточная локализация белка, PBS также может быть использован в качестве альтернативного буфера для диссекции и фиксации. После фиксации следует провести пермеабилизацию клеточных мембран с использованием промывок PTN, содержащих 0,1% или 0,3% неионогенного детергента.
- Если PBS используется для вскрытия и фиксации, наконечники пипеток следует промыть по крайней мере один раз буфером, содержащим моющее средство (например, PTN), чтобы предотвратить прилипание мозга к пластиковым наконечникам пипеток во время переноса в микроцентрифужные пробирки.
- Используя пустую стеклянную или пластиковую чашку Петри диаметром 35 мм, соорудите чашку для препарирования, содержащую силиконовый эластомер. Кратко смешайте компоненты эластомера в соответствии с указаниями производителя, разлейте по посуде диаметром 35 мм и дайте ему полимеризоваться в течение ночи на ровной поверхности. Эластомер, содержащий диссекционные чашки, следует использовать для защиты тонких кончиков препарирующих щипцов, которые могут быть легко повреждены при контакте между щипцами и более твердой поверхностью, такой как стеклянная посуда. Мы также регулярно закупаем коммерчески доступную посуду с силиконовым покрытием в интернет-магазинах. Для повышения контрастности во время вскрытия особенно полезны посуды для препарирования силиконовым эластомером, содержащие неактивированный уголь (и, таким образом, окрашенные в черный цвет).
2. Процедура рассечения мозга у взрослых
- Обезболите 3 - 5-дневного взрослого человека D. melanogaster с помощью CO2 или с помощью льда. Если вы используете лед, поместите флакон с мухами вверх дном (пробкой вниз) в ведро со льдом на ~5 минут. Помещение флакона в лед вверх дном предотвращает застревание мух в пище. После того, как мухи будут обезболены, поместите их на холодную металлическую подушку или чашку Петри, сидящую во льду, или на подушечку, выделяющуюCO2. При препарировании мозга для анализа нейродегенерации также можно использовать старых мух.
- Поместите небольшое количество (150 - 200 мкл) PTN в центр чашки для вскрытия с помощью переводной пипетки или пипетки p200, чтобы создать «пузырь» PTN. Поместите чашку для препарирования под стереомикроскоп и отрегулируйте освещение и фокус таким образом, чтобы пузырь PTN заполнял поле зрения и равномерно освещался.
- Манипулируйте мухами так, чтобы они находились «брюхом вверх» (т.е. брюшной стороной вверх), лежа на металлической или CO2 подушечке.
- С помощью одной пары щипцов #5 захватите брюшную полость мухи, которую нужно препарировать, и, удерживая муху, полностью погрузите ее в ПТН на чашке для вскрытия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для остальной части протокола все шаги должны выполняться, когда головка погружена в PTN.
- Используя вторую пару щипцов #5, возьмитесь за основание хоботка мухи и раздвиньте две пары щипцов, чтобы отделить голову мухи от тела. Отбросьте брюшную полость и грудную клетку. На этом этапе критически важно, чтобы головка не была отпущена и не была оставлена плавать на поверхности PTN. Как только голова начинает парить, ее может быть очень трудно снова схватить, не раздавив мозг.
ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого метода разрываются связи между мозгом и вентральным нервным канатиком. Если требуются интактные соединения между этими областями ЦНС, следует придерживаться альтернативного протокола диссекции. Если хоботок отделится от головки мухи до того, как головка будет удалена, на месте хоботка останется отверстие. В этом случае возьмитесь за головку мухи за край отверстия возле одного глаза. Затем снимите головку, используя умеренное усилие, оттягивая две пары щипцов друг от друга. Иногда, когда голова отделяется от тела, кишечник и/или вентральный нервный канатик остаются прикрепленными к голове и должны быть удалены перед продолжением вскрытия.
- В то время как одна пара щипцов захватывает хоботок, вторая пара должна захватывать медиальный край правого глаза мухи. Медленно оттяните щипцы друг от друга. Этот шаг следует выполнять с небольшим количеством устойчивой боковой силы. По мере того, как щипцы медленно отдаляются друг от друга, хоботок должен оторваться от головки и создать центральное отверстие в кутикуле головки. Откажитесь от хоботка с помощью первой пары щипцов, не освобождая медиальную часть правого глаза от второй пары.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мозг взрослой особи D. melanogaster находится в каудальной (т.е. задней/задней) области головы мухи. Таким образом, следует избегать захвата этой области головы. В идеале щипцами следует непосредственно захватывать только ростральную (т.е. переднюю) часть головы рядом с медиальной сетчаткой. Теперь мозг и связанная с ним трахея должны быть видны через центральное отверстие в кутикуле. В это время любые белые волокнистые нити трахеи, выступающие из отверстия, можно удалить и выбросить.
- Второй парой щипцов захватите медиальный край левой сетчатки (по краю центрального отверстия в кутикуле головки). Чтобы удалить сетчатку и связанную с ней кутикулу, медленно оттяните щипцы друг от друга под углом 180°. По мере того, как сетчатка диссоциирует от нижележащей зрительной доли, вы должны почувствовать небольшое снижение напряжения. Действуйте медленно, чтобы не допустить разрыва лепестка зрительного нерва.
ПРИМЕЧАНИЕ: Слишком быстрое отделение щипцов на этом этапе может привести к разрыву зрительной доли или нарушению структур тела гриба. Иногда кутикула удаляется, но части сетчатки остаются прикрепленными к зрительной доле. При визуализации тел грибов нет полной необходимости удалять всю сетчатку. Тем не менее, анализ других областей мозга (таких как иннервация нейронов сетчатки в долях зрительного мозга) может потребовать полного удаления сетчатки, как описано здесь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку сетчатка медленно отделяется от нижележащей зрительной доли мозга, оптическую долю следует наблюдать как непрозрачную белую структуру, покрытую белой волокнистой трахеей. После удаления одной сетчатки ее можно выбросить. При анализе путей поиска нейронов сетчатки на этом этапе следует проявлять особую осторожность, чтобы предотвратить повреждение зрительной доли. Также доступен дополнительный протокол, ориентированный на препарирование и визуализацию фоторецепторных нейронов в реальном времени.
- Теперь аккуратно удалите как можно большую часть видимой трахеи. Трахея может уже содержать воздух или позже наполняться им, заставляя мозг плавать и, возможно, теряться на последующих этапах иммуноокрашивания. Чтобы удалить трахею, извлеките ее из мозга с помощью очень острой пары щипцов #5.
- Удалите оставшуюся сетчатку и окружающую кутикулу, используя обе пары щипцов, чтобы захватить медиальную область сетчатки левой мухи. Осторожно разорвите сетчатку пополам, чтобы удалить кусочки сетчатки и кутикулы. В некоторых случаях удаление оставшейся кутикулы без раздавливания мозга оказывается особенно сложной задачей. В этих случаях мы обнаружили, что оставшиеся нити вентрального нервного канатика могут быть захвачены одной парой щипцов, в то время как другая пара щипцов используется для осторожного удаления остатков кутикулы.
- С помощью пипетки p200 переместите препарированный мозг в одну лунку 9- или 3-луночной чашки, содержащей PTN. Мозги одного и того же генотипа должны быть объединены в одну и ту же лунку и храниться на льду. Ткань мозга должна быть зафиксирована в течение одного часа после вскрытия. Мозги могут быть зафиксированы небольшими партиями и объединены, если требуется большее количество мозгов. В большинстве случаев опытный исследователь обычно может препарировать мозг и перенести его в стеклянную чашку для сбора примерно за 3-5 минут.
