$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Koyle et al., Raising the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp.(2016).
1. Подготовьте клетки для откладывания яиц
- Приготовьте пластины для агара из виноградного сока, разогрев в микроволновой печи 100 мл воды, 10 г пивных дрожжей, 10 г глюкозы и 1 г агара. Доведите до кипения 3 раза на шаге 1.1 и добавьте 10 г замороженного концентрата виноградного сока для повышения видимости яиц на агаровой пластине.
- Когда агар остынет до 55 °C, налейте 20 мл в 100 мм чашки Петри и дайте застыть.
- Поверхность агаровых пластин покрыть дрожжевой пастой, смешав 1 г пивных дрожжей с 15 г воды. Налейте дрожжевую пасту на агаровую пластину, убедившись, что поверхность покрыта, затем слейте излишки, оставив тонкий дрожжевой остаток. Если используется несколько пластин, пасту можно последовательно разливать на несколько пластин
.
- Перенесите агаровые пластины на дно клетки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Контейнер для деликатесов на 32 унции является хорошей заменой акриловым клеткам для мух.
- Сделайте крышки для контейнеров для деликатесов на 32 унции, вырезав отверстие в верхней части и приклеив дышащую сетку поверх отверстия с помощью нетоксичного клея. Если клей водорастворимый, не допускайте попадания воды на крышку.
- Переложите 200-300 мух в контейнер и накройте крышкой. Закройте защищенное сеткой отверстие пустой крышкой чашки Петри, чтобы предотвратить испарение с поверхности агара, и при желании добавьте влажную папиросную бумагу внутрь крышки. Инкубировать мух при температуре 25 °C в течение ночи в течение 16-20 часов.
2. Собираем яйца
- Подготовьте сито для сбора яиц, поместив капроновую сетку в пластиковую втулку.
- Чтобы извлечь тарелку с находящимися на ней яйцами, удалите мух из клетки, переложив в пустую емкость. Если на следующий день будут использоваться те же мухи, немедленно пересадите их в новую клетку, содержащую только что приготовленную тарелку с агаром из дрожжевого виноградного сока. Мух можно использовать в течение 3-5 дней подряд
- Удаляйте мертвых мух с агара чистой кистью, стараясь не разбить агар.
- Собирайте яйца, промыв агаровую пластину дистиллированной водой, аккуратно смахивая яйца с поверхности агара и поливая сетку суспензией. Повторите 3-4 раза, пока все или большая часть яиц не будут удалены из агаровой пластины.
3. Дехорионатные яйца и перевод на стерильную диету
- Подготовьте шкаф биобезопасности, распылив изнутри (включая боковые стенки) 70% этанола. Протрите дно лабораторной салфеткой и простерилизуйте вытяжку ультрафиолетовым излучением в течение ~15 минут. Стерилизуйте все небиологические принадлежности (чашки для образцов, кисть, щипцы, контейнер для отходов, 400 мл стерилизованной воды и 100 мл 0,6% гипохлорита натрия) путем распыления этанола и немедленного помещения в шкаф для биологической безопасности. Стерилизовать ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут.
- Начните первую из 2 промывок гипохлоритом натрия, поместив втулку с яйцами в чашку для образцов объемом 120 мл или другую стерильную емкость. Медленно налейте ~90 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия во втулку чуть ниже обода.
- Промойте яйца в течение 2,5 мин. Периодически повторно суспензируйте яйца, перемещая втулку вверх и вниз в растворе гипохлорита.
- Перенесите втулку непосредственно во вторую чашку для образцов, предварительно заполненную 90 мл отбеливателя, внутрь шкафа биобезопасности.
- Повторите шаг 3.3 внутри шкафа биобезопасности. По окончании второй обработки хлорной известью яйца должны начать прилипать к бокам куста.
- Выполните действия 3.7-3.8 в шкафу биобезопасности.
- Выбросьте отбеливатель и промойте втулку стерильной водой 3 раза. Повторно подвешивайте яйца несколько раз во время каждой мойки, перемещая втулку с помощью щипцов. К концу третьей промывки большая часть яиц должна быть прикреплена к боковой части втулки.
- С помощью стерилизованной в этаноле кисти переведите яйца со стороны куста на стерильный рацион. Перекладывайте яйца по отдельности или небольшими партиями. Стремитесь к 30-50 яйцам на флакон. Оставьте колпачки свободными, чтобы кислород мог проникнуть в трубку.