$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Koyle et al., Rising the Fruit Fly Drosophila melanogaster Under Axenic and Gnotobiotic Conditions, J. Vis. Exp. (2016).
1. Дехорионат яиц и перевод на стерильную диету
- Подготовьте шкаф биобезопасности, распылив изнутри (включая боковые стенки) 70% этанола. Протрите дно лабораторной салфеткой и простерилизуйте вытяжку ультрафиолетовым излучением в течение ~15 минут. Стерилизуйте все небиологические принадлежности (чашки для образцов, кисть, щипцы, контейнер для отходов, 400 мл стерилизованной воды и 100 мл 0,6% гипохлорита натрия) путем распыления этанола и немедленного помещения в шкаф для биологической безопасности. Стерилизовать ультрафиолетовым излучением в течение 15 минут.
- Начните первую из 2 промывок гипохлоритом натрия, поместив втулку с яйцами в чашку для образцов объемом 120 мл или другую стерильную емкость. Медленно налейте ~90 мл 0,6% раствора гипохлорита натрия во втулку чуть ниже обода.
- Промойте яйца в течение 2,5 мин. Периодически повторно суспензируйте яйца, перемещая втулку вверх и вниз в растворе гипохлорита.
- Перенесите втулку непосредственно во вторую чашку для образцов, предварительно заполненную 90 мл отбеливателя, внутрь шкафа биобезопасности.
- Повторите шаг 1.3 внутри шкафа биобезопасности. По окончании второй обработки хлорной известью яйца должны начать прилипать к бокам куста.
- Выполните действия 1.7-1.8 в шкафу биобезопасности.
- Выбросьте отбеливатель и промойте втулку стерильной водой 3 раза. Повторно подвешивайте яйца несколько раз во время каждой мойки, перемещая втулку с помощью щипцов. К концу третьей промывки большая часть яиц должна быть прикреплена к боковой части втулки.
- С помощью стерилизованной в этаноле кисти переведите яйца со стороны куста на стерильный рацион. Перекладывайте яйца по отдельности или небольшими партиями. Стремитесь к 30-50 яйцам на флакон. Оставьте колпачки свободными, чтобы кислород мог проникнуть в трубку. Если флаконы должны оставаться аксеническими, переложите их в инкубатор для насекомых; В противном случае добавьте бактерии, как показано ниже.
2. Создание гнотобиотических мух, используя 4 вида бактерий
- Подготовьте бактерии
- Подготовьте стерилизованный шкаф биобезопасности с необходимыми принадлежностями (пипетками, коробками для наконечников для пипеток, стерилизованными центрифужными пробирками, бульоном MRS и штативами для пробирок), как описано в шаге 1.1. Протрите пробирки снаружи лабораторной салфеткой, пропитанной этанолом, перед помещением в биобезопасный шкаф.
- Гранулируйте бактерии, сначала перенеся 500 μл ночного роста в стерильную микрофуговую пробирку. Если бактериальная плотность низкая, добавьте до 1,5 мл в каждую пробирку или последовательно удалите надосадочную жидкость и добавьте в ту же пробирку дополнительную культуру. Извлеките образцы из шкафа биобезопасности и центрифугируйте на 10 минут при давлении 10 000 x g. Используйте фильтрующие наконечники, чтобы избежать загрязнения между образцами.
- Определите плотность каждой культуры, измерив наружный диаметр600. При использовании считывателя с несколькими лунками переведите 200 мкл каждой культуры на 96-луночный планшет в 1-, 2- и 4-кратных разведениях.
- Определите количество mMRS, в котором следует разбавить каждую клеточную гранулу (2.1.2), используя пластинчатый спектрофотометр и следующие уравнения. Планируйте добавить достаточное количество бульона для инокуляции 50 мкл в каждую флакон от мухи.
- Соберите показания OD600 для разведения каждой бактериальной культуры в соотношении 1:1, 1:2 и 1:4 на спектрофотометре с планшетным считыванием. Выберите степень разведения для каждого штамма бактерий, который дает значение OD600 в диапазоне от 0,1 до 0,2, и используйте это значение и соответствующий коэффициент разбавления как 'O' и 'D' в формулах, приведенных в пунктах 2.1.4.2 или 2.1.4.3.
- При использовании 4 описанных здесь видов нормализуйте клетки до эквивалентных плотностей колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл (конверсия OD600 в КОЕ, определенная ранее в Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) с использованием этого уравнения:
E = ((O-B) x V x D)/C
где E = объем для ресуспендирования гранул в (μl), O = OD600 бактерий, B = OD600 пустой среды, D = кратное разведение, V = μl бактериальной культуры до центрифугирования, C = OD600 от заданной константы. Примеры расчетов с использованием этих уравнений см. в дополнительном файле кода. Для спектрофотометров, которые автоматически гасятся, используйте "O" вместо "O-B".
ПРИМЕЧАНИЕ: Определены предопределенные константы (единицы наружного диаметра600, нормализованные до 107 КОЕ мл-1, константы, полученные в Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)): A. tropicalis (0,052), A. pomorum (0,038), L. brevis (0,056), L. plantarum (0,077).
- При использовании других видов бактерий (константа КОЕ/ОД600 недоступна), нормализуйте плотность до наружного диаметра600 = 0,1 с помощью этого уравнения:
E = ((O-B) x V x D)/0,1 OD600
ПРИМЕЧАНИЕ: Единицы измерения такие же, как и на шаге 2.1.4.2. Примеры расчетов с использованием этих уравнений см. в дополнительном файле кода.
- В шкафу биобезопасности удалите надосадочную жидкость с помощью наконечника пипетки и повторно суспендируйте гранулу в свежем mMRS или PBS, как рассчитано на шаге 2.1.4.2.
- Инокуляция бактерий
- Перенесите 50 μл бактерий в конические пробирки со стерильным питанием и дехорионированными яйцами в биозащитном шкафу. Добавьте бактерии после переноса яиц, чтобы предотвратить загрязнение между флаконами.
- Поместите инокулированные пробирки в инкубатор при температуре 25 °C.
3. Измерьте нагрузку КОЕ/Испытание на стерильность
- Чтобы измерить концентрацию КОЕ в гомогенатах мух по всему телу, перенесите 5 мух (через 5-7 дней после эксклюзии) в пробирку с микрофугой объемом 1,7 мл, содержащую 125 мкл керамических шариков и 125 мкл бульона mMRS. Гомогенизация мух с помощью тканевого гомогенизатора в течение 30 секунд со скоростью 4,0 М/с.
- В качестве альтернативы можно опустить шарики и вручную гомогенизировать в микроцентрифужных пробирках с пластиковыми пестиками в течение 1 минуты.
- При количественном определении микробиоты кишечника стерилизуйте мух на поверхности для удаления экзогенных микробов. Перенесите мух в микроцентрифужную пробирку, содержащую 100 мкл 70% этанола, на 1 мин, отсадите этанол и переложите в новую микроцентрифужную пробирку для гомогенизации. Если содержание ДНК в кишечнике будет измерено, промойте в течение 1 минуты 0,6% гипохлоритом натрия перед промыванием этанолом.
- Разбавьте гомогенат 875 мкл mMRS, вихревой в течение 5 сек и напипируйте 120 мкл гомогената в первой лунке микротитрового планшета.
- Выполните два последовательных разведения 1:8 с использованием 10 мкл гомогената и 70 мкл MRS в следующих двух лунках.
- Удалите 10 μл из первой лунки и добавьте ее во вторую лунку, содержащую 70 μл MRS. Тщательно перемешайте содержимое второй лунки, переложите 10 μл из второй лунки в третью лунку, содержащую 70 μл MRS, и тщательно перемешайте. Это приводит к 3 общим концентрациям исходного гомогената в 1000 μl: неразбавленный, 1:8 и 1:64.
- Перенесите 10 мкл каждого разведения на планшет mMRS (при желании с использованием многоканальной пипетки). Слегка наклоните посуду, чтобы развести разбавление на несколько миллиметров вниз по поверхности агара и дайте жидкости высохнуть, прежде чем перемещать тарелку. Жидкость быстро высыхает на пластине, если пластины 2-дневной давности, уменьшая смешивание двух соседних капель.
- Выдерживать при 30 °C в течение 1-2 дней. Извлеките планшеты из инкубатора, как только отдельные колонии станут видны, и отсчитайте от разведения до 10-100 изолированных колоний.
- Рассчитайте КОЕ на муху, используя уравнение E = C x D/P x V/F, где E = КОЕ на муху, C = количество подсчитанных колоний, D = разбавление, P = μl покрытых, V = объем гомогената мух и F = количество гомогенизированных мух.