$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Guan et al., Visualize Leg Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp.(2018).
1. Рассечение и фиксация ноги
- Возьмите стеклянную многолуночную пластину и заполните соответствующее количество лунок 70% этанолом. Добавьте 15–20 мух под наркозом CO2 (любого пола и любого возраста) в каждую лунку и с помощью щетки аккуратно промокните мух в растворе этанола><, пока мухи полностью не погрузятся в воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в удалении гидрофобности кутикулы. Не умываться более 1 минуты, так как при этом увеличивается автофлуоресценция кутикулы.
- Промойте мух 3 раза 0,3% раствором неионогенного поверхностно-активного средства в 1x фосфатно-солевом буфере (PBS). Держите мух в этом растворе не менее 10 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ноги лучше фиксируются при включении моющего средства, что с большой вероятностью увеличит проникновение фиксатора внутрь ноги.
- Положите на лед многолуночную пластину вместе с пробиркой с 4% параформальдегидом (PFA).
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовление свежего 4% PFA из 16% исходного раствора без этанола PFA имеет решающее значение.
- Используйте щипцы для удаления головы и брюшной полости мух, не повреждая грудной сегмент или ноги.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удаление брюшка облегчает удержание мухи и рассечение ног.
- Рассеките ноги из грудного сегмента с помощью щипцов и поместите ноги в лунки, содержащие 4% PFA. Для этого мягко, но сильно надавите на стык тазобедренно-грудной клетки с помощью кончика тонких щипцов до тех пор, пока нога не отсоединится.
- Зафиксируйте ноги в 4% PFA на ночь при температуре 4 °C (всего примерно 20 часов).
- Вымойте ноги 0,3% раствором неионогенного поверхностно-активного средства в 1 раз PBS, 5 раз по 20 минут каждая.
- Замените моющий буфер на монтажное средство. Перед установкой держите ножку в монтажной среде не менее суток, чтобы обеспечить ее полное проникновение в ножку.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если монтажная среда очень вязкая, разбавьте ее до 80% с помощью 1x PBS, потому что резкое изменение вязкости может привести к разрушению кутикулы и повреждению общей структуры ноги. В зависимости от драйвера Gal4 мухи могут храниться от 1 до 3 недель при температуре 4 °C в монтажном материале до монтажа.
2. Крепление на ножке
Поместите примерно 20 мкл 70% глицерина на левую сторону предметного стекла микроскопа и накройте его квадратным покровным стеклом размером 22 x 22 мм 2 (Рисунок 1 A,B).- Пипетируйте около 10 мкл монтажной среды вдоль линии, параллельной и на небольшом расстоянии от правого края этого покровного стекла. Добавьте еще 30 μL монтажного материала дальше с правой стороны затвора (Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: При наложении покровного стекла на ножки (см. ниже) монтажный материал будет аккуратно растекаться под покровным стеклом и вокруг ножек, не смещая их.
- С помощью тонких щипцов поднимите ногу из раствора и аккуратно положите ее на монтажную среду возле левого покровного стекла. Проделайте то же самое для каждой ноги и выровняйте их сверху вниз (Рисунок 1D).
- Поднимите и переведите ноги в каплю среднего размера, удерживаемую между обоими кончиками щипцов. Ориентируйте ножки двумя способами: внешней стороной вверх или вниз.
- После того, как все ножки (можно установить до 6–8 ножек) будут правильно выровнены, наденьте второй покровный лист на ножки так, чтобы этот покровный стекло слегка опирался на ранее установленный покровный стекло Рисунок 1E, чтобы обеспечить пространство между покровным стеклом и тканью и предотвратить повреждение ножек (Рисунок 1G).
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте колодцы для наклеек или ортодонтический воск, чтобы создать пространство между покровным стеклом и предметным стеклом.
- Используйте лак для ногтей, чтобы зафиксировать положение покровных стекол на каждом углу (Рисунок 1F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь ткань готова к визуализации.
