$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол взят из Radford and McKim, Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes, J. Vis. Exp. (2016).
ПРИМЕЧАНИЕ: Процедуры выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Инкубаторы с регулируемой температурой используются для поддержания температуры при выращивании мух и скрещивании, если не указано иное.
1. Подготовка
- Подготовьте мух.
- Обогащенные прометафазой сборы ооцитов.
- Очистите взрослых мух от здоровых, молодняка или кросс-культур. Выдержка в бутылках в течение двух дней при температуре 25 °C.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, достаточно двух здоровых бутылок, хотя для некоторых кросс-культур может потребоваться больше.
- Через два дня соберите от ~100 до 300 самок (которым на данный момент от 0 до 2 дней) из бутылок. Самкам не обязательно быть девственницами. Добавьте немного дрожжевой пасты на боковую сторону флакона и поместите по 30 самок и от 10 до 15 самцов в дрожжевые флаконы. Состарить флаконы в течение двух суток при температуре 25 °C.
- Обогащенные метафазой сборы ооцитов.
- Соберите от ~100 до 300 самок из пород или кросс-культур. Добавьте немного дрожжевой пасты на боковую сторону флакона и поместите по 30 самок (без добавления самцов) в дрожжевые флаконы. Выдерживайте флаконы от трех до пяти дней при 25 °C.
- Готовьте растворы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Растворы можно хранить неограниченное время при комнатной температуре, если не указано иное.
- Приготовьте модифицированный буфер Робба (5x): 500 мМ HEPES, 500 мМ сахарозы, 275 мМ ацетата натрия, 200 мМ ацетата калия, 50 мМ глюкозы, 6 мМ хлорида магния и 5 мМ хлорида кальция. Используйте 10 N 11:8 гидроксид натрия: гидроксид калия, чтобы довести pH до 7,4. Стерилизовать фильтрацией; Не автоклавировать. Хранить при температуре -20 °C. Размораживайте по мере необходимости, чтобы приготовить ~200 мл 1x Robb's на ооцит.
- Решения для фиксации.
- Вариант #1: Приготовьте фиксацию формальдегидом/гептаном. Приготовьте фиксирующий буфер: 1x фосфатно-солевой буфер (PBS) плюс 150 мМ сахарозы. Для использования приготовьте свежий с 687,5 мкл фиксирующего буфера и 312,5 мкл 16% формальдегида на ооцит преп.<бр/>
осторожность: Надевайте перчатки во время использования растворов формальдегида в вытяжном шкафу. Утилизируйте отходы в соответствии с руководящими принципами учреждения.
- Вариант #2: Приготовьте фиксацию формальдегидом/какодилатом. Приготовьте смесь Fix: 250 мМ сахарозы, 100 мМ ацетата калия (pH 7,5), 25 мМ ацетата натрия (pH 7,0) и 25 мМ EGTA (pH 8,0). Для использования приготовьте фреш из 400 мкл Fix Mix, 100 мкл какодилата калия (1 М, pH 7,2) и 500 мкл 16% формальдегида на одну ооцитную подготовку
осторожность: Какодилат калия содержит мышьяк.
- Приготовьте PBS/Triton X-100: 1x PBS плюс 1% или 0,05% Triton X-100. Хранить при температуре 4 °C.
- Приготовьте PBS-Tween 20-бычий сывороточный альбумин (BSA) (PTB): 1x PBS, 0,5% BSA (w/v) и 0,1% Tween-20. Может храниться при температуре 4 °C в течение одной недели.
2. Коллекция ооцитов дрозофилы на поздней стадии
- Поскольку ооциты дрозофилы с неповрежденными мембранами прилипают к пластику и стеклу, предварительно покройте внутреннюю часть одной пробирки объемом 5 мл и одной пипетки Пастера на ооцит препаратом PTB.
- Обезболите всех ~100-300 дрожжевых мух углекислым газом и добавьте в блендер, содержащий ~100 мл 1x Robb's Buffer. Импульс три раза (~1 сек каждый). Держите ооциты в Robb's в течение <20 минут, чтобы избежать активации.
ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, ооциты могут быть препарированы вручную у самок. Преимущество этого метода в том, что он требует меньше самок. Тем не менее, необходимо соблюдать осторожность, чтобы ограничить воздействие углекислого газа всего несколькими минутами, чтобы избежать артефактов, связанных с гипоксией.
- Отфильтруйте через крупную ячею (~1 500 мкм) в стакан объемом 250 мл, чтобы удалить крупные части тела. Если на сетке осталось много неповрежденных брюшков, повторно измельчите материал с помощью дополнительного буфера Робба и снова отфильтруйте. Дайте отстояться ~2 минуты, затем отсасывайте верхний слой, удаляя как можно больше крупных частей тела.
- Отфильтруйте через мелкую ячейку (~300 мкм) в стакан объемом 250 мл. Промойте оставшиеся яйцеклетки из первого стакана с помощью дополнительной пипетки Робба и пипетки Пастера с покрытием. Дайте отстояться ~3 минуты; Ооциты осядут. Отсасывайте все, кроме ~10 мл.
- Налейте столько 10 мл, сколько поместится в пробирку объемом 5 мл с покрытием. Дайте отстояться, удалите жидкость и повторите с остатком. Промойте оставшиеся ооциты из стакана с помощью дополнительной пипетки Робба и пипетки Пастера с покрытием. Дайте отстояться в пробирке объемом 5 мл на ~3-5 минут.
3. Медикаментозное лечение (по желанию)
- Нанесите на вторую пробирку объемом 5 мл ПТБ для каждого препарата ооцита. Добавьте соответствующий растворитель (контроль) или препарат в 1 мл Robb's для каждого препарата ооцитов (Таблица 1).
- Разделите ооциты на вторую пробирку объемом 5 мл с покрытием. Дайте отстояться, удалите жидкость и добавьте 1 мл растворителя Robb's plus в одну пробирку и 1 мл препарата Robb's plus во вторую пробирку. Нутате в течение соответствующего количества времени для лечения препаратом (Таблица 1). Дайте отстояться.
4. Фиксация
- Отсадите всю жидкость и сразу же добавьте 1 мл Фикса.
- Вариант #1: Фиксация формальдегидом/гептаном (Фиксирующий буфер плюс 5% формальдегида).
- Зафиксируйте на 2,5 минуты на нутаторе. Добавьте 1 мл гептана и вортекс 1 мин. Дайте отстояться ~1 минута.
- Удалите всю жидкость, а затем добавьте 1 мл 1x PBS. Вихрь 30 сек. Дайте отстояться ~1 минута.
- Удалите всю жидкость, а затем заполните трубку 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты можно использовать немедленно или держать на нататоре в течение нескольких часов при комнатной температуре.
- Вариант #2: Фиксация формальдегидом/какодилатом (Fix Mix плюс 8% формальдегида и 100 мМ какодилата).
- Закрепить на 6 мин на нутаторе. Дайте отстояться 2 минуты. Удалите жидкость, а затем заполните трубку 1x PBS.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ооциты можно использовать немедленно или держать на нататоре в течение нескольких часов при комнатной температуре.
5. Удаление мембран ("скручивание")
- Используя пипетку Пастера с покрытием, добавьте от ~500 до 1000 ооцитов к матовой (подвергнутой пескоструйной обработке) части предметного стекла. Удалите все части тела и посторонние материалы с помощью щипцов. Не допускайте пересыхания яйцеклеток; при необходимости добавьте 1x PBS.
- Поместите покровное стекло поверх ооцитов и аккуратно «скатайте» ооциты, пока все мембраны не будут удалены (лучше всего работает перетаскивание края покровного стекла по ооцитам). Периодически проверяйте прогресс под микроскопом, при необходимости добавляя еще 1x PBS. Будьте осторожны, так как слишком большое давление разрушит ооциты.