Этот протокол представляет собой выдержку из книги Перкинса и Бикеля "Использование флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) для мониторинга состояния когезии рук в прометафазе и метафазе I ооцитах дрозофилы", J. Vis. Exp. (2017).
1. Удаление хорионов и вителлиновых оболочек
ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите Рисунок 1 для необходимых инструментов.
- Отделение ооцитов на поздней стадии
- Добавьте 1 мл PBSBTx в неглубокую посуду для препарирования. Используйте P200 с наконечником, покрытым BSA, чтобы перенести фиксированные яичники (в ~150 мкл) в неглубокую чашку. Пипетка ведет яичники вверх и вниз с помощью наконечника пипетки с покрытием BSA, чтобы вытеснить зрелые ооциты из менее зрелых ооцитов.
- Когда ооциты на поздней стадии достаточно отделены, перенесите всю ткань в микрофугальную пробирку объемом 500 мкл. Удалите лишнюю жидкость с помощью вытянутой пастеровской пипетки, оставив в пробирке около 150 - 200 мкл. Повторите раздел 1.1 для остальных генотипов.
- Подготовка к прокатке
- Предварительно смочите глубокую чашку 200 мкл PBSBTx. Накройте крышкой и отставьте в сторону. Возьмите 3 предметных стекла из матового стекла и отложите слайд #3 в сторону. Аккуратно потрите участки матового стекла слайдов #1 и #2 друг о друга. Промойте их в деионизированной воде, чтобы удалить осколки стекла, и высушите одноразовой салфеткой.
- Смажьте матовые участки слайдов #1 и #2 PBSBTx, добавив 50 μL PBSBTx на одно предметное стекло и протерев эту область другим слайдом. Удалите жидкость одноразовой салфеткой.
- Поместите предметные стекла под препарирующий микроскоп в конфигурации, показанной на рисунке Рисунок 2A. Держите матовые участки слайдов #1 и #2 в контакте, при этом слайд #3 поддерживает слайд #2.
- Перекатывайте ооциты; убедитесь, что направление перекатывания всегда находится по прямой линии, а не по кругу.
- Предварительно смочите наконечник для пипетки P200 в PBSBTx и диспергируйте ооциты в микрофуге-пробирке путем пипетирования вверх и вниз. Перенесите 50 μл жидкости, содержащей ооциты, в центр части из матового стекла на слайде #1. Для этого поднимите горку #2.
- Медленно опускайте слайд #2 до тех пор, пока поверхностное натяжение жидкости не создаст уплотнение между двумя областями матового стекла. Жидкости должно быть достаточно, чтобы покрыть покрытый инеем участок, но она не должна просачиваться. Если жидкость переполнилась, удалите лишнюю жидкость с помощью пастеровской пипетки.
- Удерживайте нижнюю горку (#1) на месте одной рукой, а другой рукой перемещайте верхнюю горку (#2) вперед и назад в горизонтальном направлении, удерживая слайд #2 ровно и опираясь на слайд #3. Выполняйте работу под микроскопом для легкой визуализации движений и прогресса ооцитов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Это движение вызовет трение и заставит ооциты «перевернуться» и потерять свои хорионы. Следует использовать минимальное давление, а движения должны быть короткими и быстрыми.
- После нескольких движений в горизонтальном направлении немного измените угол движения (рисунок 2B). С несколькими шагами постепенно увеличивайте этот угол до 90°, пока движение верхней горки не станет перпендикулярным начальному направлению (Рисунок 2B). Обратите внимание, что в жидкости будут видны пустые хорионы, а ооциты, лишенные хорионов, будут казаться длиннее и тоньше.
- Повторяйте шаги 1.3.3 - 1.3.4 около 7 - 10 раз, пока раствор не станет слегка мутным. Прекратите сворачивание, когда большинство ооцитов (75 - 85%), по-видимому, утратили свои вителлиновые мембраны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Характерный заостренный конец часто виден на ооцитах, лишенных вителлиновых мембран. Мембраны Vitelline удалить сложнее, чем хорионы. Легкое давление может быть приложено к верхнему ползуну (слайд #2) во время прокатки для удаления вителлиновых мембран. Попытка удалить вителлиновые мембраны из всех ооцитов часто приводит к разрушению других ооцитов.
- Аккуратно приподнимите верхнюю горку (#2), перетащив один из ее углов к центру матовой области нижней горки (#1) так, чтобы в центре матовой области скопились свернутые ооциты. Промойте ооциты с обоих предметных стекол с помощью PBSBTx в глубокую пробирку, содержащую PBSBTx.
- Очистите горки #1 и #2 сверхчистой водой, высушите одноразовой салфеткой и сбросьте на место. Повторяйте шаги 1.3.1 - 1.3.6 до тех пор, пока не будут свернуты все ооциты одного и того же генотипа. Обычно для этого требуется 3 - 4 раунда перекатывания на каждый генотип.
- Удалите мусор после прокатывания
- Добавьте 1 мл PBSBTx в коническую пробирку объемом 15 мл. Взболтайте жидкость, чтобы покрыть боковые стороны трубки.
- С помощью наконечника пипетки P1000 с покрытием PBSBTx перенесите свернутые ооциты из глубокой лунки в коническую трубку, содержащую 1 мл PBSBTx. Добавьте еще 2 мл PBSBTx в коническую трубку, содержащую ооциты.
- Дайте ооцитам начать оседать на дно, затем удалите верхние 2 мл раствора, содержащего мусор (хорионы, вителлины и т.д.) с помощью P1000 и выбросьте. При необходимости держите коническую трубку на темном фоне, чтобы увидеть непрозрачные ооциты, когда они опускаются.
- Добавьте еще 2 мл PBSBTx в ооциты и повторите шаг 1.4.3. Повторите пункт 1.4.3. Всего 3 раунда разбора обломков.
- С помощью наконечника пипетки P1000 с покрытием PBSBTx перенесите ооциты обратно в исходную микропробирку объемом 500 мкл. От 20 до 25 самок должно получить примерно 50 мкл свернутых зрелых ооцитов.
- Повторите раздел 4 для остальных генотипов, используя свежие матовые предметные стекла, чистую чашку для глубокого колодца и новую коническую трубку для каждого генотипа.
- При необходимости хранения переведите ооциты в 1x PBS с 0,1% TritionX-100 и храните в течение ночи при температуре 4 °C. Длительное хранение не рекомендуется, поскольку сшивание формальдегида может быть обращено вспять неионогенными детергентами.
