Нарушение кутикулы: метод сбора гемолимфы из личинок дрозофил

Аннотация

Источник: Reimels, T. A. and Pfleger, C. M. Методы исследования лимфатических желез и гемоцитов у личинок дрозофилы. J. Vis. Exp. (2016).

Гемолимфа дрозофилы служит как кровью, так и интерстициальной жидкостью, циркулируя по всему телу на стадии личинки и взрослой особи. В этом видео описан протокол сбора личиночной гемолимфы с целью количественного определения циркулирующих клеток.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Reimels and Pfleger, Methods to Examine the Lymph Gland and Hemocytes in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp.(2016).

1. Концентрация циркулирующих гемоцитов

1. Чтобы получить личинки примерно одинаковой стадии развития для этого анализа, ограничьте сбор яиц, позволив самкам откладывать яйца в течение фиксированного периода времени от 2 до 6 часов.
2. Соберите личинки в лунки для препарирования, наполненные 1x фосфатно-солевым буфером (PBS).
3. Для каждой личинки поместите 10 л 1x PBS в микроцентрифужную пробирку на льду и 10 л 1x PBS на чистую диск для препарирования. Поместите диск для препарирования на основание стереомикроскопа с подсветкой.
4. Высушите отдельную личинку, поместив ее на тканевую салфетку, прежде чем переложить ее в каплю PBS на диск для вскрытия.
5. С помощью щипцов аккуратно разорвите и осторожно выверните кутикулу, чтобы освободить гемолимфу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не поцарапать и не уколоть кутикулу, так как это потенциально может привести к высвобождению сидячих гемоцитов.
6. С помощью пипетки соберите гемолимфу с препарирующей подушечки. Избегайте сбора личиночных остатков, таких как жировое тело.
7. Добавьте гемолимфу в микроцентрифужную пробирку и перемешайте пипетированием вверх и вниз><. ПРИМЕЧАНИЕ: Сразу можно собрать несколько образцов и держать их на льду до часа.
8. По желанию: Смешайте трипановый синий с образцом гемолимфы в равных частях, чтобы окрасить и исключить омертвевшие клетки. Подсчитайте клетки в течение 3 минут после добавления трипанового синего, потому что он токсичен для клеток.
9. Перемешайте образец с помощью пипетирования вверх и вниз перед загрузкой 10 мкл в камеру гемоцитометра.
10. Если вы используете автоматический счетчик ячеек, установите соответствующие параметры для размера и цикличности ячеек. Например, установите минимальный размер ячейки 2 мкм, максимальный размер клетки 22 мкм и круговость 75–80% округлости, чтобы обнаружить нормальные круглые гемоциты. Экспериментируйте с различными параметрами, чтобы обнаружить более крупные и веретенообразные гемоциты, такие как ламеллоциты. В качестве альтернативы можно использовать гемоцитометр для ручного подсчета гемоцитов.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Таблетки PBS	MP Biomedicals	2810305
Тарелка для препарирования	Корнинг	7220-85
Микроцентрифужная трубка	Денвилл	С2170
силиконовая губка для препарирования, изготовленная из набора Sylgard 184	Krayden (распространяется через Fisher)	NC9644388 (каталожный номер Фишера)	Изготовлен в чашке Петри путем смешивания компонентов комплекта эластомеров Sylgard в соответствии с инструкциями производителя.
Стереомикроскоп	Morrell Instruments (дистрибьютор Nikon)	МНА42000, ММА36300	Модели Nikon SMZ1000 и SMZ645
Салфетка	ВВР	82003-820
щипцы	Науки электронной микроскопии	72700-ДЗ
Пипетка P200	Эппендорф	3120000054
Автоматизированный счетчик ячеек Countess	Инвитроген	С10227
Предметные горки камеры для подсчета клеток графини	Инвитроген	С10283
гемоцитометр	Хауссер Сайентиал	3200
Трипановая синяя морилка	Технологии Life	Т10282