Диссекция комплекса глаз-мозг у куколок мух: метод выделения ткани сетчатки

Abstract

Источник: DeAngelis, M. W., Johnson, R. I. Вскрытие сетчатки куколки дрозофилы для иммуногистохимии, западного анализа и выделения РНК. J. Vis. Exp.(2019).

В этом видео описывается, как препарировать и изолировать глазо-мозговой комплекс у куколок дрозофилы. Представленный протокол демонстрирует процедуру, позволяющую получить высококачественную ткань, совместимую, например, с иммуноокрашиванием, а также с другими экспериментами по экспрессии генов.

Protocol

Этот протокол является выдержкой из DeAngelis and Johnson, Dissection of the Drosophila Pupal Retina for Immunohistochemistry, Western Analysis, and RNA Isolation, J. Vis. Exp.(2019).

1. Подготовка тканей

1. Проводите скрещивание дрозофил (как описано ранее в Greenspan, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (2004)) или специфичные для культуры штаммы дрозофилы для получения куколок желаемого генотипа. Чтобы гарантировать одновременное появление большого количества куколок, установите эти культуры мух в двух экземплярах на богатых питательными веществами пищевых средах или стандартных пищевых средах, щедро дополненных дрожжевой пастой.
2. Поддерживайте культуру дрозофилы при температуре 25 °C. Для скрещиваний с использованием системы UAS-GAL4, GMR-GAL4 является идеальным драйвером, экспрессируемым в клетках диска глаза личинки позади морфогенетической борозды и на протяжении всего развития куколки. Скрещивание UAS-lacZ X GMR-GAL4 служит идеальным контрольным скрещиванием, поскольку оно стимулирует экспрессию неэндогенного и инертного белка β-галактозидазы.
3. Используйте кончик 6-дюймовой бамбуковой шины, смоченной в дистиллированной воде, чтобы осторожно поднять белые предкуколки (Рисунок 1B) с бортика флаконов для здоровой культуры (Рисунок 1A) и поместите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл (Рисунок 1C).
4. Поместите пробирки в пластиковую коробку для наконечника для пипетки вместе с небольшим кусочком салфетки, смоченным в дистиллированной воде, чтобы поддерживать в камере достаточную влажность и защитить куколок от высыхания (Рисунок 1D). Инкубируйте куколок при температуре 25 °C до вскрытия.
5. Используйте сухую бамбуковую шину 6 дюймов, чтобы аккуратно вытолкнуть куколок из микроцентрифужной пробирки на черную чашку для препарирования. Положите свежий кусок двустороннего скотча на тарелку для препарирования вдали от куколок.
6. С помощью щипцов осторожно положите куколки тыльной стороной вверх (т.е. оперкулумами вверх, рисунок 1B) на ленту (рисунок 2A). Следите за тем, чтобы куколки хорошо прилегали к ленте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Влага на куколке препятствует надежному приклеиванию к ленте, и в этом случае дайте куколкам высохнуть на воздухе перед размещением на двусторонней ленте.

2. Вскрытие глазо-мозговых комплексов

1. Используйте щипцы для удаления оперкулума каждой куколки (Рисунок 2C).
2. С помощью ножниц для микродиссекции разрежьте или разрежьте куколку каждой куколки. Откройте лоскут куколки, чтобы открыть головку, грудную клетку и передний брюшной сегмент, закрепив края куколки двусторонней лентой (Рисунок 2C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не стоит полностью раскрывать куколки.
3. Проткните живот каждой куколки острыми щипцами, чтобы схватить животное, и извлеките его из куколочного корпуса (рисунок 2C).
4. Поместите куколок на черную чашку для вскрытия, подальше от ленты, и налейте около 400 μL ледяного фосфатно-буферного раствора (PBS, pH 7,4).
5. Возьмите каждую куколку за живот щипцами и с помощью ножниц для микродиссекции сделайте чистый поперечный разрез через всю грудную клетку, разрезав куколку пополам (Рисунок 2D).
6. Удалите задние остатки каждой туши из PBS и отложите в сторону на тарелку для препарирования (не выбрасывайте, см. шаг 3.2.1).
7. С помощью двух пар тонких щипцов раскройте грудную клетку и головку каждой куколки, чтобы выявить комплекс глаз-мозг (рисунок 2E). Для этого нужно захватить края надрезов эпителия грудной клетки и постепенно разорвать, чтобы открыть грудную клетку, а затем и капсулу головы, обнажив комплекс глаз-мозг и окружающую жировую ткань.
8. Не захватывая ткань, используйте щипцы, чтобы направить комплекс глаз-мозг в сторону от остатков капсулы головы или зачерпните комплекс глаз-мозг из разорванной капсулы головы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Комплекс глаз-мозг имеет форму гантели, грязно-белый и более прозрачный, чем окружающий жир кремового цвета (Рисунок 2B,E).
9. С помощью щипцов осторожно удалите большую часть жира, связанного с комплексами глаз-мозг, не трогая ткани глаза.

3. Обработка тканей для иммунофлюоресценции

1. Рассеките не менее 6-10 куколок, как описано (шаги 2.1-2.9).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Три-четыре независимых повторения каждого вскрытия, как правило, дают достаточно данных для проверки гипотезы.
2. Промывание и фиксация
   1. Отрежьте кончик наконечника пипетки P20 или P100 чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить радиус отверстия наконечника до ~1 мм, и смажьте его пипетированием путем пипетирования смеси PBS и жира вверх и вниз. Этот жир можно получить из остатков туши, удаленных на шаге 2.6.
   2. Перенесите комплексы глаз-мозг в ~400 мкл PBS в стеклянной чашке на 9 лунок на льду. Используйте смазанный наконечник и микропипетку вытеснения P20 или P100 для переноса.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глазо-мозговые комплексы будут прилипать к несмазанными наконечниками во время пипетирования и будут повреждены или потеряны.
   3. Удалите оставшийся жир, связанный с тканью глаза, с помощью пипетирования PBS вверх и вниз, чтобы мягко закрутить комплексы глаз-мозг. На этом и всех последующих этапах мытья не пипетируйте напрямую глазно-мозговые комплексы вверх и вниз, так как это может повредить хрупкую ткань глаза.
   4. Переведите комплексы глаз-мозг в минимальном объеме (<20 мкл) PBS в не менее 250 мкл фиксатора. Перемешайте, пипетируя раствор вверх и вниз. Инкубировать в течение 35 минут, на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого можно использовать тот же смазанный наконечник, который был подготовлен на шаге 3.1.1.
   5. С помощью того же наконечника пипетки перенесите комплексы глаз-мозг в лунку, содержащую ~400 мкл PBS. Перемешайте пипеткой раствор вверх и вниз и выдержите 5-10 минут на льду, чтобы промыть. Повторите этап стирки не менее двух раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Глазо-мозговые комплексы можно поддерживать в течение нескольких часов при окончательной промывке PBS, на льду или при 4 °C, прежде чем переходить к шагу 3.3.1.
3. Окрашивание антителами
   1. Чтобы блокировать ткань перед воздействием растворов антител, перенесите комплексы глаз-мозг в ~400 мкл PBT. Для переноса используйте смазанный наконечник и микропипетку вытеснения P20 или P100. Выдерживать от 10 до 60 минут на льду.
   2. Приготовьте первичный раствор антител путем разведения соответствующих антител в ПБТ. Поскольку комплексы глаз-мозг инкубируются в 10 мкл аликвот раствора антитела, приготовленный объем будет репликацией 10.
   3. Аликвоту 10 мкл раствора антитела в чистую лунку 72-луночного микролуночного лотка.
   4. Отрежьте кончик наконечника пипетки P10 чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить радиус отверстия наконечника до ~0,5 мм, и смажьте его путем дозирования PBT вверх и вниз.
   5. Перенесите не более 5 комплексов глаз-мозг в объеме <3 мкл PBS в каждую 10 мкл лунки раствора антител с помощью микропипетки вытеснения P10 и смазанной кончика.
   6. Гомогенизируйте раствор антитела путем дозирования раствора вверх и вниз. Не пипетируйте комплексы глаз-мозг вверх и вниз, так как это может повредить ткани.
   7. Чтобы свести к минимуму испарение раствора антитела, поместите небольшой кусочек ткани, смоченный в дистиллированной воде, в лоток для микролунок и закройте лоток (например, с прилагаемой крышкой). Выдерживать в течение ночи при температуре 4 °C.
   8. Переложите комплексы глаз-мозг из лотка с микролунками в ~400 мкл PBT в стеклянную посуду на 9 лунок для мытья. Используйте микродозатор P10 для вытеснения воздуха и наконечник со смазкой из ПБТ (подготовьтесь, как описано в шаге 3.3.4). Перемешайте, пипетируя раствор вверх и вниз. Выдерживать 5-10 минут на льду.
   9. Повторите этап стирки как минимум дважды. Используйте микропипетку вытеснения P20 или P100 и наконечник со смазкой из PBT для переноса комплексов глаз и мозга между растворами для промывки.
   10. Приготовьте раствор вторичного антитела путем разведения соответствующих вторичных антител, меченных флуорофорами, в PBT по мере необходимости. 100 мкл раствора вторичного антитела достаточно на партию из 6-10 куколок. Аликвотируйте вторичный раствор антитела в 9-луночный стеклянный стаканчик для препарирования.
   11. Перенесите комплексы глаз-мозг во вторичный раствор антител. Для переноса используйте микропипетку вытеснения P20 или P100 и наконечник со смазкой из PBT.
   12. Комплексы глаз-мозг инкубируют во вторичном растворе антител в течение 1-2 ч при комнатной температуре или 3-5 ч при 4 °С. Чтобы предотвратить обесцвечивание флуорофоров светом, накройте препарат фольгой.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная продолжительность инкубации в растворе вторичного антитела может варьироваться в зависимости от используемых первичных и вторичных антител.
   13. Переведите комплексы глаз-мозг в ~400 мкл PBT в стеклянную посуду на 9 лунок для мытья. Перемешайте, пипетируя раствор вверх и вниз. Выдерживать 5-10 минут на льду. Этот этап стирки следует повторить как минимум дважды.
4. Вторичная фиксация
   1. Для вторичной фиксации необходимо перевести глазо-мозговые комплексы в объеме не менее 200 мкл фиксатора и инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре или 35 мин при 4 °C.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Вторичная фиксация укрепляет ткани глаза, что способствует монтажу (шаг 3.5).
   2. Используйте микропипетку вытеснения P20 или P100 и смазанный ПБТ наконечник для переноса глаз-мозговых комплексов в ~400 мкл ПБТ в стеклянной посуде на 9 лунок со льдом и промывайте в течение 5 минут.
   3. Повторите этап стирки хотя бы один раз.
   4. Используйте микропипетку вытеснения P20 или P100 и смазанный PBT наконечник для переноса глаз-мозговых комплексов в ~400 μL PBS в стеклянной чашке на 9 лунок со льдом для полоскания в течение 1-2 мин. Поддерживайте ткань в движении, пипетируя PBS, но не ткань, вверх и вниз, чтобы предотвратить оседание и прилипание комплексов глаз-мозг к стеклянной чашке во время PBS-полоскания.
5. установка
   1. Перенесите комплексы глаз-мозг в ~200 мкл монтажной среды. Используйте микропипетку вытеснения P20 или P100 и наконечник с PBT-смазкой для переноса комплексов глаз-мозг. Дайте ткани сбалансироваться в монтажных средах в течение 1-2 часов.
   2. Нанесите каплю свежего монтажного материала объемом 5-8 мкл на чистое предметное стекло микроскопа.
   3. Отрежьте наконечник P10 чистым лезвием бритвы, чтобы увеличить радиус отверстия наконечника до ~0,5 мм, и используйте его и микропипетку вытеснения P10 для переноса комплексов глаз-мозг в 5-8 мкл монтажного материала в каплю монтажного материала на предметном стекле.
   4. С помощью двух вольфрамовых игл отделите глаза от долей зрительного нерва. Прикрепите к предметному стеклу комплекс глаз-мозг с помощью прочной вольфрамовой иглы и отрежьте каждый глаз от связанной с ним зрительной доли тонкой вольфрамовой иглой (Рисунок 2F).
   5. С помощью тонкой вольфрамовой иглы переместите каждый глаз к поверхности предметного стекла микроскопа так, чтобы базальная поверхность каждого глаза примыкала к предметному стеклу. Аккуратно опустите чистый чехол-слип на салфетку и закрепите лаком для ногтей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение глаз на предметном стекле таким образом, чтобы они находились близко друг к другу или на одной линии, облегчит последующую микроскопию.
   6. Визуализируйте сетчатку с помощью флуоресцентной или конфокальной микроскопии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предметные стекла следует хранить при температуре 4 °C, если они не были сфотографированы сразу.

Results

Рисунок 1: Отбор и культивирование куколок для вскрытия. (A) Блуждающие личинки третьего возраста (L3) и куколки располагаются по бокам здоровых культур дрозофилы. (B) Предкуколки могут быть идентифицированы по их полупрозрачному белому цвету, поскольку пигмент еще не образовался в защитном корпусе куколки. Передне-задняя и дорсально-вентральная ось куколки показаны синим цветом...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Бамбуковые шины, 6"	Тед Пелла Инк	116
Черная тарелка для препарирования			Стеклянная чашка Петри наполнена до краев SYLG170 или SYLG184 (окрашена в черный цвет с помощью мелко измельченного порошка древесного угля). Оставьте при комнатной температуре на 24-48 ч для полимеризации.
Держатель лезвия	Инструменты для точной науки	10053
Бычий сывороточный альбумин	Сигма-Олдрич	А7906
Двусторонний скотч	3 МИН.	665
Дрозофилы и пищевые среды, богатые питательными веществами			7,5% сахароза, 15% глюкоза, 2,5% агар, 20% пивные дрожжи, 5% пептон, 0,125% MgSO4,7H2O, 0,125% CaCl2,2H20
Дрозофилы и пищевые среды, стандартные			Рецепт кукурузной муки Bloomington Drosophila Stock center. (https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/bloomfood.html)
Фиксирующий раствор			4% формадегода в PBS, pH 7,4.
щипцы	Инструменты для точной науки	91150-20	Щипцы следует часто затачивать.
формальдегид	Термо Сайентиал	No 28908
Стеклянная посуда на 9 лунок	Корнинг	7220-85	Также известны как блюда на 9 лунок
Стеклянные покровные стекла (22 x 22 мм)	Научный центр Фишера	12-542-Б
Предметные стекла для микроскопа (25 x 75 x 1 мм)	Научный центр Фишера	Тел.: 12-550-413
Стеклянная чашка Петри	Корнинг	3160-100БО
глицерин	Сигма-Олдрич	Г5516
Микроцентригурные трубки	Аксиген	MCT-175-C
Ножницы для микродиссекции	Инструменты для точной науки	15000-03
Лотки для микролунок (72 лунки по 10 мкл)	Нунк	438733
Монтажный носитель			0,5% N-пропилгаллата и 80% глицерина в PBS
N-пропилгаллат	Сигма-Олдрич	П3130
PBS (фосфатно-солевой буфер pH 7,4)	Сигма-Олдрич	П5368	Готовьте в соответствии с инструкциями производителя
ПБТ			0,15% TritonX и 0,5% бычьего сывороточного альбумина в PBS, pH 7,4
Держатель штифта	Инструменты для точной науки	26016-12
Первичное антитело: козий анти-GAPDH	Имгенекс	ИМГ-3073	Для вестерн-блоттинга. Использовано в 1:3000
Первичное антитело: кролик против расщепленного Dcp-1	Клеточная сигнализация	9578С	Для иммунофлюоресценции. Использовано в масштабе 1:100
Первичное антитело: крысиный анти-DEcad	Исследования в области развития, Банк гибридома	DCAD2	Для иммунофлюоресценции. Использовано в 1:20
Первичное антитело: крысиный анти-DEcad	DOI: 10.1006/dbio.1994.1287	ДКАД1	Подарок от Тадаси Уэмуры. Использовано в масштабе 1:100.
Лезвия скальпеля	Инструменты для точной науки	10050	Отломите небольшой кусочек лезвия и закрепите в держателе лезвия.
Вторичное антитело: 488-конъюгированный ослиный антикрысиный IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	712-545-153 (Английский)	Для иммунофлюоресценции. Использовано в 1:200
Вторичное антитело: cy3-конъюгированный козий антикролик IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	Тел.: 111-165-144	Для иммунофлюоресценции. Использовано в масштабе 1:100
Вторичное антитело: HRP-конъюгированный козий антикрысиный IgG (H+L)	Технология клеточной сигнализации	7077	Для вестерн-блоттинга. Использовано в 1:3000
Вторичное антитело: HRP-конъюгированный кролик против козьего IgG (H+L)	Иммуноисследования Джексона	305-035-003 (Английский	Для вестерн-блоттинга. Использовано в 1:3000
Стерео препарирующий микроскоп (M60 или M80)	Leica Microsystems		или подобный микроскоп
Сильгард (черный)	Индекс Dow Corning	SYLG170
Сильгард (прозрачный)	Индекс Dow Corning	SYLG184	Цвет черный с мелко измельченной пудрой шарколь
Салфетка: Кимвайпы	КИМТЕХ	No 34120 (Английский
ТритонКс	Сигма-Олдрич	Т8787
Вольфрамовая игла, тонкая	Инструменты для точной науки	10130-10	Вставка в держатель штифта
Вольфрамовая игла, прочная	Инструменты для точной науки	10130-20	Вставка в держатель штифта
Дрожжевая паста	(местный супермаркет)		Примерно 2 столовые ложки дрожжей Fleischmann's ActiveDry (или аналогичных) растворены в ~20 мл дистиллированной H2O