дрозофила Поздняя диссекция куколки с помощью непрямой мышцы полета (IFM): метод высокопроизводительного сбора тканей

Аннотация

Источник: Kao, S. Y., et al. Рассечение летательных мышц Drosophila melanogaster для омиксных подходов. J. Vis. Exp. (2019).

Летательные мышцы дрозофилы используются в качестве модельной системы для развития мышц и физиологии. В этом видео описывается летная мускулатура взрослых особей и освещается протокол препарирования развивающихся непрямых летательных мышц, которые подходят для секвенирования РНК из куколок.

Протокол

Этот протокол является выдержкой из Kao et al., Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches, J. Vis. Exp. (2019).

1. Рассечение IFM после 48 ч APF

1. Соберите необходимое оборудование, включая два щипца класса биологии #5, тонкие ножницы, стандартные предметные стекла для микроскопа, двойную ленту, пипетку, наконечники для пипеток, сухой лед и (для применения на основе РНК) изоляционный реагент (см. Таблицу материалов). Охладите 1x PBS и микроцентрифужные пробирки на льду.
2. С помощью слегка смоченной кисти перенесите этапированные куколки на полоску двустороннего скотча, закрепленную на предметном стекле микроскопа (Рисунок 1A). Расположите куколок в линию, ориентированную в одной и той же ориентации (вентрально вниз и спереди к нижней части предметного стекла).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, не используйте слишком много воды на кисти или фильтре, иначе куколки не будут хорошо прилипать. Если куколки не прилипают, высушите их, предварительно переложив на сухой фильтр или папиросную бумагу. Посадите столько куколок, сколько можно расчленить за 30 минут, в идеале ~10 куколок.
3. Извлеките куколку из корпуса куколки. Используйте щипцы, чтобы раздразнить и открыть куколку над передними дыхальцами (Рисунок 1B).
4. Осторожно сдвиньте пару щипцов дорсально к задней части, разрезая куколку по мере движения щипцов (Рисунок 1B'). Будьте осторожны, чтобы не разорвать нижележащую куколку. Освободите куколку из открытого футляра и немедленно перенесите ее в каплю 1x PBS на предметное стекло второго микроскопа (рисунок 1B",C).
5. Повторите шаги 1.3 и 1.4 для всех куколок в линии, затем отложите салазку с двойным скотчем в сторону.
6. С помощью тонких ножниц отрежьте брюшную полость куколки от грудной клетки и сведите ее в отдельную кучу (рисунок 1D,D'). Повторите для оставшихся куколок.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Начните отсчитывать продолжительность диссекции с шага 1.6, как только целостность куколки будет нарушена. Препарируйте как можно больше мух за 20–30 минут, чтобы предотвратить гибель клеток и связанные с ней транскриптомные и протеомные изменения. При препарировании 1 д. взрослых особей или >90 ч куколок, часто бывает удобно для более поздних этапов дополнительно удалить голову тонкими ножницами.
7. С помощью папиросной бумаги удалите большую часть 1x PBS (обычно мутную со взвешенным жиром), а также кучу живота (Рисунок 1E). Добавьте каплю свежего, охлажденного 1x PBS к оставшимся грудным клеткам.
8. С помощью ножниц разрежьте грудную клетку пополам (Рисунок 1F,F'), разрезая от головы вниз по продольной оси тела одним движением. В качестве альтернативы, если голова была удалена, сначала вставьте ножницы в то место, где была прикреплена голова, и разрежьте верхнюю половину грудной клетки в продольном направлении между ИФМ. Затем разрежьте брюшную сторону грудной клетки вторым разрезом в той же ориентации.
9. Повторите шаги 1.7 и 1.8 для всех куколок, подлежащих препарированию, создав кучу гемисекций грудной клетки вблизи центра предметного стекла. Убедитесь, что на предметном стекле достаточно охлажденного 1x PBS, чтобы гемисекции не высыхали.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После 48 ч APF МФМ становятся достаточно большими, чтобы их можно было увидеть под стандартным препарирующим микроскопом для тренированного глаза. На этом этапе протокола мышцы с флуоресцентной меткой могут быть перемещены в флуоресцентный препарирующий эндоскоп для облегчения идентификации IFM или для тренировочных целей, но это не обязательно.
10. Рассеките ИФМ из грудной клетки. Изолируйте одну из гемисекций с помощью щипцов #5 (Рисунок 1G,H). Аккуратно вставьте кончики одного щипца выше и ниже середины IFM (Рисунок 1G',H'). Удерживая первые щипцы, с помощью тонких ножниц отрежьте один конец IFM от кутикулы и сухожилий. Затем отрежьте другой конец IFM от кутикулы (Figure 1G'',H'').
    ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от ориентации грудной клетки после первого разреза IFM, полезно повернуть грудную клетку на 180°, чтобы было легче выполнить второй разрез IFM.
11. Извлеките пучок IFM из грудной клетки с помощью щипцов (Рисунок 1G''',H'''), перенеся его на край пузыря PBS, чтобы использовать натяжение воды для удержания его на месте (Рисунок 1I). Отодвиньте тушку к противоположной стороне предметной горки. Повторите то же самое для остальных гемисекций грудной клетки, создав коллекцию расчлененных ИФМ.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если IFM не остаются в аккуратной стопке, удалите часть 1x PBS с помощью салфетки. Будьте осторожны, чтобы не дать всем PBS испариться, и убедитесь, что расчлененные IFM и гемитораксы остаются покрытыми буфером.
12. После вскрытия всех ИФМ быстро проведите контроль качества рассеченной мышцы. С помощью щипцов #5 удалите все прыгающие мышцы или фрагменты кутикулы, которые могли попасть в образец (Figure 1J-K'').
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прыжковая мышца отличается от IFM. Если препарировать меченую Mef2-Gal4 мышцу под флуоресценцией, прыгающая мышца будет иметь более слабую флуоресценцию и другую форму и текстуру. При нормальном освещении он выглядит почти полупрозрачным, в то время как ИФМ имеют непрозрачный, молочно-желтый цвет (Figure 1J-J'',K).
13. Используя натяжение воды, захватите (но не сжимайте) рассеченные IFM между парой щипцов (Рисунок 1L). Переложите ИФМ в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, предварительно заполненную 250 мкл охлажденного 1x PBS (Рис. 1M). Немедленно приступайте к разделу 2.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Когда кончики щипцов приближаются друг к другу и поднимаются из буферного раствора, натяжение воды приводит к тому, что пузырь буфера захватывается между кончиками щипцов. Если в этом пузыре также присутствуют ИФМ, их можно извлечь из раствора и легко перенести в другую емкость, заполненную буфером. Важно сжать щипцы так, чтобы кончики приблизились друг к другу, не касаясь друг друга, чтобы избежать мацерации ткани, захваченной буферным пузырем.

2. Гранулы и консервация образца IFM

1. Гранулируйте ИФМ, центрифугируя микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл в течение 3–5 минут при температуре 2 000 x g в настольной центрифуге (Рисунок 2A,B).
2. Извлеките буфер с помощью наконечника для пипетки (рисунок 2C).
3. Для применения РНК ресуспендируйте гранулу IFM в 50–100 мкл требуемого буфера для выделения РНК (см. Таблицу материалов, Рисунок 2D). В противном случае переходим к шагу 2.4.
   ПРИМЕЧАНИЕ: ИФМ могут быть заморожены сухим способом после этапа 2.2 для препаратов масс-спектрометрии или выделения РНК с помощью коммерческих наборов (см. репрезентативные результаты). Для применения РНК лучшие результаты достигаются при немедленной суспендии и замораживании гранулы IFM в изоляционном буфере.
4. Заморозьте образец на сухом льду или мгновенно заморозьте в жидком азоте (Рисунок 2E). Хранить при температуре -80 °C до готовности к последующим этапам подготовки образцов к последующему анализу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После криоконсервации образцы могут храниться в течение нескольких месяцев перед обработкой для последующих исследований.

Результаты

Рисунок 1: Рассечение ИФМ через 48 ч APF. (А) Выравнивание куколок на двойной клейкой ленте. (В) Удаление куколок из куколки путем вскрытия спереди, разрезания футляра дорсально (В') и поднятия куколки (В''). Символы круга представлены так же, как на рисунке 2. (В) Перенос куколок в буфер. (D) Удаление б...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Тарелки для культивирования 60 мм	Сигма-Олдрич	Z643084-600 шт.	Чашки Greiner, 60 мм x 15 мМ, вентилируемые
Камера мобильного телефона, Samsung Galaxy S9	Самсунг	СМ-Г960Ф/ДС	используется для фотографий, сделанных не под микроскопом
Двойная клейкая лента	Скотч/3М	Идентификатор 3M 70005108587	Двусторонняя лента, доступная у большинства погрузчиков канцелярских принадлежностей
Щипцы Dumont #5	Инструменты для точной науки	11252-20	Щипцы с прямым наконечником из нержавеющей стали 11 см, класс биологии, с наконечником 0,05 мм x 0,02 мм
флуоресцентная камера для препарирования, камера Leica DFC310 FX	Лейка		www.leica-microsystems.com
Программное обеспечение для флуоресцентного препарирующего микроскопа, Leica Application Suite (LAS) версии 4.0.0	Лейка		www.leica-microsystems.com
Флуоресцентный препарирующий микроскоп, Leica M165 FC	Лейка		www.leica-microsystems.com
Муха: Bru1[M2]			Нахлыстовый скот; Этот документ
Муха: Bru1[M3]			Нахлыстовый скот; Этот документ
Муха: Mef2-GAL4	Блумингтонский фондовый центр	БДСК:27390	Нахлыстовый приклад
Муха: salm[1]	Блумингтонский фондовый центр	No 3274	Нахлыстовый приклад
Муха: salm[FRT]			Поголовье мух; см. Spletter et al., Elife, 2018
Полет: UAS-Bru1IR	Венский исследовательский центр дрозофил	GD41568	Маховый приклад, шпилька для РНК-интерференции
Муха: UAS-GFP::Gma	Блумингтонский фондовый центр	БДСК:31776	Нахлыстовый приклад
Муха: UAS-mCD8a::GFP	Блумингтонский фондовый центр	БДСК:5130	Нахлыстовый приклад
Муха: w[1118]	Блумингтонский фондовый центр	No 3605	Нахлыстовый приклад
Муха: weeP26			Стадо мух; см. Clyne et al., Genetics, 2003
Реагент для обнаружения GFP, GFP-Booster	ХромоТек	ГБА488-100
гликоген	Инвитроген	10814-010
Программное обеспечение для обработки изображений, Photoshop CS6	саман		www.adobe.com
Изопропанол	Сигма-Олдрич	И9516-25МЛ	2-пропанол
Метод 1 (выделение РНК): ТРИзол	Технологии Life	15596018	Изотиоцианат гуанидиния и монофазный фенол
Метод 2 (выделение РНК): Метод 1 + набор TURBO DNA-free	Инвитроген	АМ1907	Выделение тризола с последующим лечением набором для удаления ДНК
Метод 3 (выделение РНК): набор Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit	Исследование Zymo	Р2070С	Выделение РНК в TRIzol, но над коммерческими колонками вместо использования разделения фаз. Рекомендуемое лечение ДНКазой Monarch Dnase I в буфере для реакции Monarch DNase I.
Метод 4 (выделение РНК): RNeasy Plus Mini Kit	Цягэн	No 74134	Мы использовали предоставленную ДНКазную терапию. Гранулы IFM гомогенизировали в буфере RTL, как это было предложено для тканей животных.
Метод 5 (выделение РНК): система ReliaPrep RNA Tissue Miniprep	Компания Promega	З6110	Мы применили протокол «Очищение РНК от фиброзных тканей».
Метод 6 (выделение РНК): набор Monarch Total RNA Miniprep Kit	Биолаборатории Новой Англии	Т2010Г	Мы применили протокол для тканей/лейкоцитов и лизировали 300 мкл реагента для защиты РНК.
Микроцентрифужные пробирки	Термо Фишер	AM12400	Пробирки для микрофуги без РНКазы, 1,5 мл
Предметные стекла для микроскопа	Термо Фишер	12342108	Стандартные слайды, незаряженные, 1 мм
кисть	Марабу	1910000000	Marabu Fino Round No. 0, или аналогичная кисть из любого художественного расхода
Параформальдегид	Сигма-Олдрич	158127
Буфер PBS (1 шт.)	Сигма-Олдрич	П4417	Фосфатно-солевые буферные таблетки для 1 л растворов, pH 7,4
Наконечники для пипеток PFA PureTip	Элементарные научные	ЕС-7000-0101	Опциональный заменитель стандартных наконечников для дозатора для снижения потерь пробы; 100 мл, отверстие 0,8 мм
Наконечники для пипеток	Сигма-Олдрич	П5161	Универсальные наконечники для пипеток объемом 200 мл
Концентрация РНК Подход 1 и следы целостности РНК, Биоанализатор	Agilent Technologies	G2939BA
Подход к концентрации РНК 2, Nanodrop	Термо Фишер	НД-2000
Концентрация РНК Подход 3, Флуориметр Qubit 4	Инвитроген	Вопрос 33238
РНКаза А	Компания Promega	А7937
Вода без РНКазы, диэтилпирокарбонат (ДЭПК)	Сигма-Олдрич	Д5758	DEPC обрабатывают водой в течение ночи, а затем проводят автоклав, чтобы удалить всю РНКазу.
RT Kit #1: Набор обратной транскриптазы Super Script III	Инвитроген	18080-044	Комплект для обратной транскрипции
RT Kit #2: LunaScript	Биолаборатории Новой Англии	Е3010С	Комплект для обратной транскрипции
RT Kit #3: QuantiNova Reverse Transcription Kit	Цягэн	No 205410	Комплект для обратной транскрипции
Статистическое программное обеспечение: GraphPad Prism	ГрафПад Призма		www.graphpad.com
Статистическое программное обеспечение: Microscoft Excel	Майкрософт		Приобретено в составе пакета: Office для дома и учебы 2019
Настольная центрифуга	Эппендорф	5405000760	Центрифуга Eppendorf 5425 или аналогичная
Салфетки/ Кимвайпы	Сигма-Олдрич	Z188956	Стандартные салфетки для салфеток
Трансферная пипетка	Сигма-Олдрич	Z350796	Пластиковая пипетка
Весенние ножницы Vannas	Инструменты для точной науки	15000-00	режущая кромка 3 мм, диаметр наконечника 0,05 мм, длина 8 см
Ватман	Сигма-Олдрич	1004-070	Круги из фильтровальной бумаги, Grade 4, 70 мм

раствор