$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из работы Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).
1. Визуализация кальция in vivo
- Используйте многофотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и водно-иммерсионным объективом (см. Таблицу материалов), установленный на виброизолированном столе. Для визуализации кальциевых индикаторов на основе GFP настройте лазер на длину волны возбуждения 920 нм и установите полосовой фильтр GFP.
- С помощью ручки грубой регулировки по оси Z просканируйте ось Z мозга и найдите интересующую область мозга. Используйте функцию обрезки, чтобы сфокусировать сканирование только на этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и повернуть вид сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы была обращена вниз.
- Отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 пикселей, скорость сканирования до > 4 Гц и область сканирования (в измерении Y) так, чтобы были охвачены интересующие нейроны.
2. Визуализация вызванных запахом кальциевых переходных процессов через обонятельное кондиционирование
- Используйте систему доставки запаха, которая может доставлять несколько стимулов запаха с точностью до времени.
- Используйте дополнительный компьютер для управления устройством и для связи с программным обеспечением микроскопа для визуализации, чтобы координировать стимуляцию запаха с захватом изображения во время экспериментов.
- Инициируйте предварительно запрограммированный пакет макросов, способный связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха (например, пакет макросов VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблицу материалов), который реагирует на внешний триггер ввода, обеспечиваемый инициацией протокола доставки запаха в отдельной программе).
- Начните измерение с мониторинга «предтреночных»/наивных кальциевых переходных процессов, вызванных запахом, с разрешением 512 x 512 пикселей и частотой кадров 4 Гц. Подайте стимул запаха через 2,5 с с дополнительным получением изображения в течение 6,25 с до появления запаха (чтобы установить базовое значение F0) и через 12,5 с после смещения запаха. Повторите то же самое со вторым одорантом, а затем с третьим одорантом.
- Продолжайте через 3 минуты после этого измерения с классическим кондиционированием («дрессировкой») мухи.
- Выберите один из запахов, представленных на этапе «предварительного обучения», чтобы он стал запахом CS+, а другой — запахом CS+. Подайте запах CS+ с помощью управляемой компьютером системы подачи запаха в течение 60 с одновременно с двенадцатью ударами током напряжением 90 В.
- После перерыва в 60 с используйте только запах CS-- в течение 60 с. Используйте в качестве одорантов 4-метилциклогексанол и 3-октанол. Не вводите третий одорант (например, 1-октен-3-ол) во время этой тренировки, так как он используется в качестве контроля только до (шаг 2.2) и после (шаг 2.4) фазы тренировки.
- Снова измерьте «посттренировочные» переходные процессы кальция, вызванные запахом, повторив протокол стимуляции запаха «перед тренировкой» (шаг 2.2.) через 3 минуты после окончания фазы тренировки (шаг 2.3).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время выполнения этого шага должно отражать интересующее вас время после формирования памяти (например, выполните этот шаг через 3-4 минуты после этапа обусловливания для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выживать в течение нескольких часов в этом препарате.
- Сохраняйте файлы изображений в подходящем формате (например, Tiff) для последующего анализа изображений.