Дрозофила in vivo Визуализация кальция: метод функциональной визуализации активности нейронов

Этот протокол является выдержкой из работы Hancock et al., In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning-Induced Synaptic Plasticity in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2019).

1. Визуализация кальция in vivo

1. Используйте многофотонный микроскоп, оснащенный инфракрасным лазером и водно-иммерсионным объективом (см. Таблицу материалов), установленный на виброизолированном столе. Для визуализации кальциевых индикаторов на основе GFP настройте лазер на длину волны возбуждения 920 нм и установите полосовой фильтр GFP.
2. С помощью ручки грубой регулировки по оси Z просканируйте ось Z мозга и найдите интересующую область мозга. Используйте функцию обрезки, чтобы сфокусировать сканирование только на этой области, чтобы свести к минимуму время сканирования, и повернуть вид сканирования таким образом, чтобы передняя часть головы была обращена вниз.
3. Отрегулируйте размер кадра до 512 x 512 пикселей, скорость сканирования до > 4 Гц и область сканирования (в измерении Y) так, чтобы были охвачены интересующие нейроны.

2. Визуализация вызванных запахом кальциевых переходных процессов через обонятельное кондиционирование

1. Используйте систему доставки запаха, которая может доставлять несколько стимулов запаха с точностью до времени.
   1. Используйте дополнительный компьютер для управления устройством и для связи с программным обеспечением микроскопа для визуализации, чтобы координировать стимуляцию запаха с захватом изображения во время экспериментов.
   2. Инициируйте предварительно запрограммированный пакет макросов, способный связать программное обеспечение для получения изображений и программу доставки запаха (например, пакет макросов VBA, установленный в программном обеспечении для управления микроскопом, см. Таблицу материалов), который реагирует на внешний триггер ввода, обеспечиваемый инициацией протокола доставки запаха в отдельной программе).
2. Начните измерение с мониторинга «предтреночных»/наивных кальциевых переходных процессов, вызванных запахом, с разрешением 512 x 512 пикселей и частотой кадров 4 Гц. Подайте стимул запаха через 2,5 с с дополнительным получением изображения в течение 6,25 с до появления запаха (чтобы установить базовое значение F₀) и через 12,5 с после смещения запаха. Повторите то же самое со вторым одорантом, а затем с третьим одорантом.
3. Продолжайте через 3 минуты после этого измерения с классическим кондиционированием («дрессировкой») мухи.
   1. Выберите один из запахов, представленных на этапе «предварительного обучения», чтобы он стал запахом CS⁺, а другой — запахом CS⁺. Подайте запах CS⁺ с помощью управляемой компьютером системы подачи запаха в течение 60 с одновременно с двенадцатью ударами током напряжением 90 В.
   2. После перерыва в 60 с используйте только запах CS-- в течение 60 с. Используйте в качестве одорантов 4-метилциклогексанол и 3-октанол. Не вводите третий одорант (например, 1-октен-3-ол) во время этой тренировки, так как он используется в качестве контроля только до (шаг 2.2) и после (шаг 2.4) фазы тренировки.
4. Снова измерьте «посттренировочные» переходные процессы кальция, вызванные запахом, повторив протокол стимуляции запаха «перед тренировкой» (шаг 2.2.) через 3 минуты после окончания фазы тренировки (шаг 2.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Время выполнения этого шага должно отражать интересующее вас время после формирования памяти (например, выполните этот шаг через 3-4 минуты после этапа обусловливания для исследования кратковременной памяти). Как правило, мухи могут выживать в течение нескольких часов в этом препарате.
5. Сохраняйте файлы изображений в подходящем формате (например, Tiff) для последующего анализа изображений.