$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой отрывок из Gervaise and Arur, Пространственный и временной анализ активного ERK в зародышевой линии C. elegans. J. Vis. Exp.(2016).
1. Вскрытие взрослых червей для получения гонад
- Выберите 100 - 150 WT (N2) или желаемый генотип червей на желаемой и специфической стадии развития (L1, L2, L3, L4, взрослые особи и т.д.) в 100 мкл буфера M9 в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл.
- Заполните микроцентрифужную пробирку 900 мкл буфера M9 (см. таблицу материалов). Центрифугируйте пробирки при давлении 1 000 x g в микроцентрифуге в течение 1 минуты при температуре окружающей среды.
- Аккуратно удалите 900 мкл буфера M9 и выбросьте. Удалите буфер под препарирующим микроскопом, чтобы убедиться, что черви не были случайно удалены.
- Повторите шаги 1.2 - 1.3 еще два раза со свежим буфером M9 каждый раз. Это гарантирует, что любые бактерии, которые были перенесены с червями, будут эффективно смыты.
- После окончательной промывки извлеките 900 μл буфера M9 из пробирки и выбросьте.
- Перенесите оставшиеся 100 мкл буфера M9, содержащего 100–150 червей, с наконечником микропипетки объемом 200 мкл в стеклянную чашку для часов с плоским дном. Перед использованием убедитесь, что наконечник микропипетки обрезан на отметке 10 μL. Если не обрезать кончик, черви будут
срезаны.
- Добавьте 1 - 3 мкл 0,1 М левамизола в стеклянную чашку для часов, содержащую червей в буфере M9. Аккуратно взболтайте левамизол и M9, чтобы обеспечить равномерное перемешивание, пока черви не перестанут двигаться.
ПРИМЕЧАНИЕ: Запасы левамизола можно хранить при температуре -20 °C для длительного хранения. Здесь используйте более высокую концентрацию левамизола в 1 - 3 мМ, чем было описано в литературе23, в 0,2 - 0,25 мМ для быстрой потери подвижности у животных. Если животные слишком долго лежат в жидкой суспензии, результирующие паттерны dpERK в гонадах могут быть изменчивыми (из-за стресса или недостатка питания, или и того, и другого). Более воспроизводимые формы окрашивания были достигнуты при использовании 1 - 3 мМ левамизола для диссекции.
- Присоедините две иглы 25 G к двум шприцам по 1 мл (размер шприца значения не имеет, калибр иглы имеет решающее значение). Поместите по одному шприцу в каждую руку (рисунок 1).
- Под микроскопом для препарирования расположите каждую иглу под каждым червем и над ним, как показано на рисунке 1, и сделайте тонкий надрез на червя рядом со второй глоточной луковицей ножницеобразным движением. После одного разреза червя переходите к следующему животному, пока все животные в блюде не будут разрезаны хотя бы один раз.
ПРИМЕЧАНИЕ: Имейте в виду, что шаги 1.8 - 1.9 чувствительны ко времени. Препарируйте всех червей в чашке менее чем за пять минут для воспроизведения рисунка dpERK. Более длительное время рассечения приведет к отключению сигнала dpERK, особенно в зоне 1. Отрегулируйте количество червей за раунд вскрытия (т.е. 50 червей вместо 150), если это необходимо, чтобы уложиться в отведенное время.
- В случае, если выдавленная гонада не видна во время вскрытия, не пытайтесь сделать еще один разрез на том же животном. Обычно это только стрижет животное и не приводит к выдавливанию половой железы. Вместо этого переходите к следующему животному. Черви, у которых гонады не выдавливаются, будут отображаться как таковые на предметных стеклах, которые будут сделаны в разделе 6, и могут быть проигнорированы во время визуализации
ПРИМЕЧАНИЕ: На всех этапах вскрытия и обработки важно помнить, что гонада останется прикрепленной к телу/туше. Не раздвигайте иглой половую железу и тело. Часто аберрантный разрыв в ткани гонады в попытке отделить гонаду от организма может привести к ложному сигналу антител. Тело/туша могут быть проигнорированы во время этапов визуализации, и будет изображена только гонада. Кроме того, иногда кишечные клетки также могут служить в качестве внутреннего контроля/соматического контроля для анализируемых антител.
Рисунок 1: Демонстрация положения иглы во время вскрытия. Слева: Фотография вскрытия в процессе. Справа: Положение иглы относительно червяка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
