ПЦР с одним червем: метод извлечения и амплификации геномной ДНК

Аннотация

Источник: Prior, H., et al. Быстрый и простой конвейер для генерации геномных точечных мутантов у C. elegans с использованием рибонуклеопротеинов CRISPR/Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

В этом видео описывается метод быстрого скрининга одной нематоды на генетический маркер с помощью ПЦР-скрининга. В примере протокола мы проводим скрининг на редактирование генома на основе CRISPR.

Протокол

Следующий протокол представляет собой выдержку из работы Prior et al., A Rapid and Facile Pipeline for Generate Genomic Point Mutants in C. elegans Using CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins, J. Vis. Exp. (2018).

ПЦР и генотипирование одного червя

1. Через 1–2 дня после откладки яиц перенесите F₁s в отдельные колпачки ПЦР-полосок, содержащие 7 мкл буфера для лизиса червей, используя червячную кирку (Таблица 1, Рисунок 1D, день 4–5).
2. Центрифугировать ПЦР-пробирки на максимальной скорости в течение 1 мин при комнатной температуре, чтобы довести животных до дна пробирки, и заморозить пробирки при -80 °C в течение 1 ч.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Черви могут храниться при температуре -80 °C неограниченное время.
3. Лизируйте замороженных червей в амплификаторе по следующей программе: 60 °C в течение 60 мин, 95 °C в течение 15 мин, 4 °C в удержании.
4. Настройте мастермикс для ПЦР, как показано в таблице 2.
5. Добавьте 21 μL PCR mastermix в чистые ПЦР-пробирки, а затем добавьте 4 μL лизиса червя из шага 3. Хорошо перемешайте с помощью пипетки и запустите программу ПЦР в соответствии с рекомендациями производителя (см. Таблицу материалов).
6. Очистите ПЦР-реакции с помощью набора DNA Clean and Concentrate, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Элюируйте ДНК, добавив 10 мкл воды в спиновую колонку.
7. Настройка мастермикса ферментов рестрикции, как показано в таблице 3.
8. Добавьте 10 мкл мастермикса фермента рестрикции в каждую очищенную ПЦР-реакцию и инкубируйте в течение 1–2 ч при 37 °C.
9. Раздельно расщепленные продукты ПЦР на 1,5% агарозном геле работают при напряжении 120 В с использованием 1x Трис-ацетат-ЭДТА (ТАЕ) буфера.

Результаты

Рисунок 1. CRISPR-Cas9 Инженерия локуса C. eleganssod-1. (A) Схематическая иллюстрация, изображающая экзон-интронную структуру локуса sod-1 у C. elegans. Красной полосой обозначено местоположение G93 в экзоне 3. Набор пар капсюлей отмечен красными стрелками (F1-R1). (B) Выравнивание последовательностей белков S...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Вода без нуклеазы	Synthego Inc.	предоставлено с набором sgRNA EZ kit
KCl	сигма	П5405
DNA Clean & Concentrator	Исследование Zymo	Д4004
Zymoclean Gel DNA Recovery Kit	Исследование Zymo	Д4002
Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix	Биолаборатории Новой Англии	М0494Л
Proteinase K	сигма	П2308
MgCl2	сигма	М2393
NP-40	сигма	74385
Tween-20	Научный центр Фишера	БП337-100
RNaseZap Решение для обеззараживания	Научный центр Фишера	АМ9780