$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой выдержку из Escorcia et al, Quantification of Lipidd Boundens and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).
1. Окрашивание липидов в красный Нил (NR)
- Приготовление стокового раствора NR 5 мг/мл
- Во флакон объемом 500 мл добавьте 100 мг порошка NR к 200 мл 100% ацетона.
- Накройте бутылку алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
- Перед применением раствор размешать в течение 2 ч в темноте.
- При длительном использовании храните стандартный раствор NR в плотно закрытой бутылке без воздействия света. Масштабирование складского решения NR в соответствии с потребностями исследований. Убедитесь, что в экспериментах по окрашиванию NR используется один и тот же исходный раствор, чтобы получить стабильные результаты окрашивания и визуализации.
- Приготовление рабочего раствора NR
- На каждый 1 мл 40% изопропанола (v/v) добавьте 6 μл исходного раствора NR.
- Приготовьте 600 μл рабочего раствора NR для каждого образца.
ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий рабочий раствор NR непосредственно перед окрашиванием. В зависимости от потребностей стандартного раствора NR используйте коническую пробирку с градуированной емкостью 15 мл или 50 мл.
- Подготовка червей к окрашиванию NR липидами
- Выращивайте червей до ранней стадии L4 при 20 °C на среде роста нематод (NGM), засеянной поздней стадией OP50 E. coli.
- Смойте червей с пластины 1 мл 1x фосфатно-солевого буфера + 0,01% раствора Triton X-100 (PBST) и поместите суспензию червя в микропробирку объемом 1,5 мл.
- Центрифугируйте червей при давлении 560 х г в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторяйте этот шаг до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от взвеси.
- Добавьте 100 μл 40% изопропанола в гранулу червя и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 3 минут.
- Центрифугируйте черви при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу червяка.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте большие объемы PBST, чтобы смыть червей с пластин, если вы используете пластины большего размера или окрашиваете больше червей на пластину. Не промывайте червей в PBST более чем за 15 минут до фиксации образца. Выполняйте дополнительные промывки, если надосадочная жидкость не очищена от бактерий. Проводят инкубацию в 40% изопропаноле с помощью нутатора или коромысла. Всегда следите за пробирками, чтобы убедиться, что происходит полное перемешивание пробы.
- Окрашивание липидов NR
- В темное время суток добавьте в каждый образец по 600 мкл рабочего раствора NR. Переверните трубки три раза и полностью перемешайте червей в растворе NR.
- Поверните образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
- После инкубации центрифугируйте червей при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
- Добавьте 600 μл PBST и инкубируйте образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить излишки NR пятна.
- Центрифугируйте образцы при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите все надсадочные жидкости, кроме приблизительно 50 μл><.
ПРИМЕЧАНИЕ: NR инкубация не требует перемешивания. Расселение червей является обычным явлением на этом этапе.
- Подготовка предметных стекол для микроскопической визуализации
- Повторно суспендируйте гранулу червя в оставшейся надосадочной жидкости.
- Нанесите 5 μл суспензии червя на предметное стекло микроскопа и осторожно наденьте покровное стекло, чтобы не застрять пузырьки воздуха.
- Заклейте покровное стекло лаком для ногтей перед тем, как изобразить червей.
- Подготовьте всего пару слайдов за один раз. Это гарантирует, что визуализация NR останется постоянной для всех образцов. Качество изображений, окрашенных NR, снижается через 6 часов. Дискретные липидные капли трудно наблюдать, а фоновая флуоресценция увеличивается, что мешает обнаружению сигнала NR.
- Визуализация червей, окрашенных NR
- Визуализируйте червей с 5-кратным увеличением, чтобы захватить несколько животных в поле зрения.
- Переключитесь на 10-кратное увеличение для лучшего количественного определения отдельных червей.
- Используйте канал FITC/GFP для получения изображений червей, окрашенных NR, и попробуйте разное время экспозиции, чтобы определить оптимальные условия для количественного анализа.
- Сохраняйте файлы в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время экспозиции колеблется от 100 до 1000 мс. Имея оптимальное время экспозиции, используйте его для всех образцов для поддержания согласованности изображения.