Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Abstract

Источник: Escorcia, W., et al. Количественная оценка распространенности липидов и оценка распределения липидов у Caenorhabditis elegans с помощью окрашивания Nile Red и Oil Red O. J. Vis. Exp. (2018).

Это видео описывает протокол окрашивания липидов целых неподвижных червей с помощью красителя Nile Red. Чтобы конкретно рассмотреть нейтральные липиды в ядре липидных капель, визуализируйте зеленые спектры излучения окрашенных C. elegans.

Protocol

Этот протокол представляет собой выдержку из Escorcia et al, Quantification of Lipidd Boundens and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining, J. Vis. Exp. (2018).

1. Окрашивание липидов в красный Нил (NR)

1. Приготовление стокового раствора NR 5 мг/мл
   1. Во флакон объемом 500 мл добавьте 100 мг порошка NR к 200 мл 100% ацетона.
   2. Накройте бутылку алюминиевой фольгой, чтобы избежать воздействия света.
   3. Перед применением раствор размешать в течение 2 ч в темноте.
   4. При длительном использовании храните стандартный раствор NR в плотно закрытой бутылке без воздействия света. Масштабирование складского решения NR в соответствии с потребностями исследований. Убедитесь, что в экспериментах по окрашиванию NR используется один и тот же исходный раствор, чтобы получить стабильные результаты окрашивания и визуализации.
2. Приготовление рабочего раствора NR
   1. На каждый 1 мл 40% изопропанола (v/v) добавьте 6 μл исходного раствора NR.
   2. Приготовьте 600 μл рабочего раствора NR для каждого образца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте свежий рабочий раствор NR непосредственно перед окрашиванием. В зависимости от потребностей стандартного раствора NR используйте коническую пробирку с градуированной емкостью 15 мл или 50 мл.
3. Подготовка червей к окрашиванию NR липидами
   1. Выращивайте червей до ранней стадии L4 при 20 °C на среде роста нематод (NGM), засеянной поздней стадией OP50 E. coli.
   2. Смойте червей с пластины 1 мл 1x фосфатно-солевого буфера + 0,01% раствора Triton X-100 (PBST) и поместите суспензию червя в микропробирку объемом 1,5 мл.
   3. Центрифугируйте червей при давлении 560 х г в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость и повторяйте этот шаг до тех пор, пока кишечная палочка не будет очищена от взвеси.
   4. Добавьте 100 μл 40% изопропанола в гранулу червя и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 3 минут.
   5. Центрифугируйте черви при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость, не нарушая гранулу червяка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте большие объемы PBST, чтобы смыть червей с пластин, если вы используете пластины большего размера или окрашиваете больше червей на пластину. Не промывайте червей в PBST более чем за 15 минут до фиксации образца. Выполняйте дополнительные промывки, если надосадочная жидкость не очищена от бактерий. Проводят инкубацию в 40% изопропаноле с помощью нутатора или коромысла. Всегда следите за пробирками, чтобы убедиться, что происходит полное перемешивание пробы.
4. Окрашивание липидов NR
   1. В темное время суток добавьте в каждый образец по 600 мкл рабочего раствора NR. Переверните трубки три раза и полностью перемешайте червей в растворе NR.
   2. Поверните образец в темноте при комнатной температуре в течение 2 ч.
   3. После инкубации центрифугируйте червей при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите надосадочную жидкость.
   4. Добавьте 600 μл PBST и инкубируйте образцы в темноте в течение 30 минут, чтобы удалить излишки NR пятна.
   5. Центрифугируйте образцы при давлении 560 x g в течение 1 минуты и удалите все надсадочные жидкости, кроме приблизительно 50 μл><. ПРИМЕЧАНИЕ: NR инкубация не требует перемешивания. Расселение червей является обычным явлением на этом этапе.
5. Подготовка предметных стекол для микроскопической визуализации
   1. Повторно суспендируйте гранулу червя в оставшейся надосадочной жидкости.
   2. Нанесите 5 μл суспензии червя на предметное стекло микроскопа и осторожно наденьте покровное стекло, чтобы не застрять пузырьки воздуха.
   3. Заклейте покровное стекло лаком для ногтей перед тем, как изобразить червей.
   4. Подготовьте всего пару слайдов за один раз. Это гарантирует, что визуализация NR останется постоянной для всех образцов. Качество изображений, окрашенных NR, снижается через 6 часов. Дискретные липидные капли трудно наблюдать, а фоновая флуоресценция увеличивается, что мешает обнаружению сигнала NR.
6. Визуализация червей, окрашенных NR
   1. Визуализируйте червей с 5-кратным увеличением, чтобы захватить несколько животных в поле зрения.
   2. Переключитесь на 10-кратное увеличение для лучшего количественного определения отдельных червей.
   3. Используйте канал FITC/GFP для получения изображений червей, окрашенных NR, и попробуйте разное время экспозиции, чтобы определить оптимальные условия для количественного анализа.
   4. Сохраняйте файлы в формате TIF, чтобы избежать потери данных из-за сжатия.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичное время экспозиции колеблется от 100 до 1000 мс. Имея оптимальное время экспозиции, используйте его для всех образцов для поддержания согласованности изображения.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator