$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол представляет собой выдержку из Germany et al, Isolation of Specific Neuron Populations from Roundworm Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp.(2019).
1. Подготовка и сбор старых червей для выделения клеток
ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже объясняется выделение холинергических нейронов из трансгенного штамма unc-17::GFP (OH13083), полученного из репозитория штаммов Caenorhabditis Genetics Center (CGC) в Университете Миннесоты. Крайне важно поддерживать стерильные условия, чтобы предотвратить заражение грибками или бактериями.
- Подготовка и синхронизация червей с помощью метода отбеливания, описанного Т. Штирнаглом. Для экспериментов по старению пластинчатые черви помещаются на пластины питательной среды для нематод (NGM), содержащие 25 мкМ водный раствор фтордезоксиуридина (FuDR), чтобы снизить яйценоскость и остановить вылупление яиц. Регулярно проверяйте агаровые пластины, чтобы предотвратить загрязнение или вылупление яиц, так как это приведет к ненадежным результатам.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для элементов unc-17::GFP обычно используются три пластины NGM размером 100 мм x 15 мм для выделения достаточного количества интересующих клеток.
- Соберите червей и подготовьте буферы для изоляции клеток.
- Соберите червей в коническую пробирку объемом 15 мл. Промыть червей с планшета 1,5 мл буфера M9 (1 мМ MgSO4, 85 мМ NaCl, 42 мМ Na2HPO4·7H2O, 22 мМ KH2PO, pH 7,0) и центрифугировать в течение 5 мин при 1 600 x g. Выбросьте надосадочную жидкость и промойте червей 1 мл буфера M9. Повторите центрифугирование и промойте в общей сложности пять раз, чтобы удалить как можно больше загрязнения кишечной палочкой><.
ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление антибиотиков (50 мкг/мл), таких как ампициллин, на этом этапе может помочь уменьшить бактериальное загрязнение.
- Для двух образцов приготовьте 2 мл буфера для лизиса додецилсульфата-дитиотреитола натрия (SDS-DTT): 200 мМ DTT, 0,25% (w/v) SDS, 20 mM HEPES (pH 8,0) и 3% (w/v) сахарозы.
- Приготовьте 15 мл изоляционного буфера (118 мМ NaCl, 48 мМ KCl, 2 мМ CaCl2, 2 мМ MgCl2, 25 мМ HEPES [pH 7,3]) и храните его на льду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как буфер для лизиса SDS-DTT, так и буфер для изоляции необходимо обновлять перед каждым экспериментом.
- Нарушение кутикулы и выделение одиночных клеток
- Центрифугировать животных, собранных на этапе 1.2.1, в течение 5 мин при плотности 1 600 x g. Удалите все надосадочные и суспензионные черви в 1 мл среды M9 и переложите в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
- Гранулированные червячки с центрифугированием при 1 600 x g в течение 5 мин.
- Добавьте 200 мкл буфера для лизиса SDS-DTT к червям и инкубируйте в течение 5 минут при комнатной температуре (RT). Черви должны казаться «подмигивающими» вдоль тела, если смотреть под световым микроскопом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Длительное воздействие лизисного буфера SDS-DTT может привести к гибели червей, которую можно контролировать, наблюдая за червями. Мертвые черви удлинятся и не будут скручиваться.
- Добавьте 800 μL ледяного изоляционного буфера и перемешайте, осторожно переворачивая трубку.
- Гранулировать червей в течение 1 минуты при 13 000 х г при 4 °C, удалить надосадочную жидкость и промыть 1 мл изоляционного буфера.
- Повторите шаг 1.3.5 в общей сложности пять раз, каждый раз осторожно удаляя изоляционный буфер.
- Добавить в гранулу 100 мкл протеазной смеси из Streptomyces griseus (15 мг/мл) (Таблица материалов), растворенной в изоляционном буфере, и инкубировать в течение 10−15 мин при RT.
ПРИМЕЧАНИЕ: Как и в случае с буфером для лизиса SDS-DTT, расширенное расщепление протеазы может привести к чрезмерному расщеплению белков вдоль плазматической мембраны, препятствуя выделению GFP с помощью магнитных шариков.
- Во время инкубации со смесью протеаз применяйте механическое разрушение, пипетируя образцы вверх и вниз по дну микроцентрифужной пробирки объемом 1,5 мл с наконечником микропипетки объемом 200 мкл в течение ~60−70 раз. Держите наконечник пипетки у стенки микроцентрифужной пробирки с постоянным давлением, чтобы правильно диссоциировать клетки.
- Чтобы определить стадию пищеварения, извлеките небольшой объем (~1−5 мкл) смеси для пищеварения, опустите ее на предметное стекло и осмотрите с помощью микроскопа для тканевых культур. Через 5−7 минут инкубации фрагменты червя должны заметно уменьшить кутикулу, и будет хорошо видна суспензия клеток.
- Остановить реакцию с помощью 900 мкл коммерчески доступной холодной среды L-15 Лейбовица с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и пенициллин-стрептомицина (конечная концентрация 50 ЕД/мл пенициллина и 50 мкг/мл стрептомицина).
- Гранулированные фрагменты и клетки изолированы центрифугированием в течение 5 мин при 10 000 x g при 4 °C. Гранулированные клетки еще дважды промыть гранулированными клетками 1 мл холодной среды, обогащенной L-15, чтобы убедиться в удалении излишков мусора и кутикулы.
- Суспензируйте гранулированные клетки в 1 мл среды, обогащенной L-15, и оставьте на льду на 30 минут. Возьмите верхний слой, примерно 700−800 μл, в микроцентрифужную пробирку. Этот слой содержит клетки без клеточного мусора и будет использоваться для последующей изоляции представляющих интерес клеток.
- Следуя инструкциям производителя, используйте автоматический клеточный счетчик или гемоцитометр для измерения клеточной плотности 10−25 мкл выделенных клеток.