Этот протокол представляет собой выдержку из Clarke et al., Манипуляция плоидией у Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2018).
Тетраплоидные штаммы можно проверить, подсчитав количество хромосом в их неоплодотворенных ооцитах. Флуоресцентная микроскопия может быть использована для скрининга количества пар хромосом в неоплодотворенных диплоидных ооцитах (до мейотического деления), если штамм имеет флуоресцентный маркер для хромосом. В отсутствие флуоресцентных хромосомных маркеров тетраплоидные нематоды могут быть обследованы путем фиксации нематод и окрашивания ДНК-красителем; ниже приведен протокол фиксации этанола и окрашивания цельного животного 4',6-диамидин-2'-фенилиндола дигидрохлорида (DAPI).
Окрашивание DAPI целым животным
ПРИМЕЧАНИЕ: Тетраплоидные штаммы, несущие 12 соединенных хромосомных пар, могут быть валидированы путем окрашивания этих животных DAPI и подсчета количества тел DAPI в их неоплодотворенных ооцитах.
- Поместите 5-10 μL буфера M9 на предметное стекло микроскопа, затем перенесите в каплю 6-10 нематод.
- Под препарирующим микроскопом извлеките большую часть М9 из капли, не удаляя нематоды с помощью безворсовой чистящей салфетки. Затем сразу же добавьте каплю 90% этанола объемом 10 мкл на червей. Дайте червям полностью высохнуть, но не дольше пары секунд.
- Как только этанол испарится (это можно увидеть, как это происходит под микроскопом для препарирования), добавьте еще 10 мкл 90% этанола на червей.
- Повторите шаг 3.1.3 еще три раза.
- После того как последняя капля этанола испарится, добавьте 6 μL красителя DAPI или красителя Hoechst в рекомендуемой конечной концентрации в выбранную монтажную среду (например, разбавляя 1:1000 исходную концентрацию DAPI 2 нг/мкл в M9). Для длительного хранения предметных стекол можно использовать 0,5%-фенилендиамин, растворенный в 20 мМ Tris-HCl, pH 8,8, в 90% глицерине в качестве раствора, препятствующего выцветанию, вместо только M9.
- Накройте червячков на предметном стекле защитным стеклом и заклейте края покровного стекла лаком для ногтей. Засечь в флуоресцентный микроскоп (шаг 3.1.7) не менее чем через 10 минут после добавления покровного стекла. Предметные стекла без антифейдерного эффекта могут храниться в течение нескольких дней при температуре 4 °C перед забивкой, но качество флуоресценции начинает снижаться через несколько дней.
- Используя флуоресцентный микроскоп при 100-кратном увеличении, подсчитайте количество одиночных DAPI-телец (предположительно одиночных хромосомных пар) в самой зрелой неоплодотворенной яйцеклетке, которая непосредственно прилегает к сперматеке и еще не проникла в сперматеку или матку.
- Чтобы оценить отдельные DAPI-тельца в ядре ооцита, используйте тонкую фокусировку микроскопа, чтобы медленно перемещаться от верхней части ядра ооцита к нижней части во время подсчета. Затем пересчитайте то же самое ядро, перемещая фокус в противоположном направлении (т.е. снизу вверх ядра), чтобы подтвердить подсчитанное количество тел DAPI.
- Оцените наиболее зрелый неоплодотворенный ооцит в каждой из двух гонад по меньшей мере у десяти гермафродитов на стабильный штамм Lon. Ооциты дикого типа имеют в среднем 6 DAPI-тел, 5 пар аутосом и пару половых хромосом. Наличие 12 DAPI-телец в ооците стабильных штаммов Lon указывает на то, что животные этого штамма являются либо частичными (4 комплекта аутосом, 3 Х-хромосомы), либо полными (4 комплекта аутосом, 4 Х-хромосомы) тетраплоидами.
- Рассчитайте среднее количество DAPI-телец, наблюдаемых из нескольких (не менее 10) ооцитов на штамм. Некоторые пары хромосом будут соприкасаться друг с другом или находиться прямо друг над другом, поэтому количество DAPI-телец в ооците часто меньше, чем фактическое количество хромосомных пар.
- (Необязательно) Дальнейшая валидация стабильных штаммов Lon, в которых среднее количество телец DAPI составляет 12, чтобы проверить, являются ли они полными (4A, 4X) или частичными (4A, 3X) тетраплоидами путем иммунофлуоресцентного окрашивания по отношению к белкам оси хромосомы, таким как HTP-3. Это окрашивание позволит различать пары хромосом, показывая крестообразный рисунок от отдельных несвязанных хромосом, присутствующих в частичном тетраплоиде.
