Гальваническое покрытие РНК для кормления C. elegans: метод индуцирования экспрессии целевой дцРНК в E. coli

Аннотация

Источник: Kolundzic, E., et al. Применение РНК-интерференции и экспрессии транскрипционного фактора, вызванного тепловым шоком, для перепрограммирования зародышевых клеток в нейроны у C. elegans. J. Vis. Exp.(2018).

Это видео описывает принципы лечения РНК-интерференцией у C. elegans и демонстрирует протокол подавления lin-35 в трансгенном штамме червей.

Протокол

Этот протокол взят из Kolundzic, et al, Применение экспрессии РНК-интерференции и фактора транскрипции, индуцированной тепловым шоком, для перепрограммирования зародышевых клеток в нейроны у C. elegans, J. Vis. Exp. (2018).

1. Приготовление раствора
   1. Пластины NGM-Agar (1 л)
      1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептоновой среды (например, Bacto-Peptone) и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в 95% запасе EtOH), 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 1 М CaCl2, 25 мл 1 М K2PO₄ и 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл запаса).
   2. Пластины NGM-Agar RNAi (1 л)
      1. Добавьте 3 г NaCl, 2,5 г пептоновой среды и 20 г агара. После автоклавирования добавьте 1 мл холестерина (5 мг/мл в 95% запасе EtOH), 1 мл 1 М MgSO₄, 1 мл 1 М CaCl2, 25 мл 1 М К₂ПО₄, 1 мл амфотерицина B (2,5 мг/мл запаса), 1 мл 1 М ИПТГ и 1 мл карбенициллина (50 мг/мл).
   3. LB-агар (1 л)
      1. Добавьте 10 г пептонной среды, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl, 20 г агара, 10 мл 1 М Tris pH 8,0. Добавьте H₂O в 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл и 2,5 мл тетрациклина 5 мг/мл.
   4. LB средний (1 л)
      1. Добавьте 10 г пептоновой среды, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г NaCl и 10 мл 1 M Tris pH 8,0. Добавьте H₂O в 1 л. После автоклавирования добавьте 1 мл карбенициллина 50 мг/мл.
   5. M9-буфер (1 л)
      1. Добавьте 6,0 г Na₂HPO₄, 3 г KH₂PO₄, 5 г NaCl и 50 мг желатина. Перед применением добавьте 1 мл 1 М MgSO₄.
   6. Отбеливающий раствор (10 мл)
      1. Добавьте 1 мл NaClO и 2 мл 5 N NaOH. Добавьте H2O до 10 мл.
2. Получение РНК-интерференционных планшетов
   ПРИМЕЧАНИЕ: C. elegans обычно культивируется в лаборатории на 6-сантиметровых пластинах Петри, содержащих 7,5 мл агара Nematode Growth Medium (NGM-Agar). Этот протокол оптимизирован для червей, содержащихся при температуре 15 °C. Для приготовления планшетов с НГМ используют стандартные стерильные методики, предотвращающие грибковое и бактериальное заражение. Ниже приведен протокол подготовки планшетов NGM с добавлением реагентов на РНК-интерференцию.
   1. Приготовьте 6-сантиметровые РНК-интерференционные пластины NGM-Agar, содержащие 1 мМ изопропил β-D-1-тиогалактопиранизида (IPTG) и 50 мкг/мл карбенициллина. Дайте им высохнуть в течение 24 – 48 часов при комнатной температуре в темноте¹².
      1. Храните РНК-интерференционные пластины при температуре 4 °C в темноте. Не используйте, если они старше 14 дней.
   2. Выберите клон РНК-интерференционной бактерии (Escherichia coli HT115), содержащий плазмиду L4440 с последовательностью ДНК гена lin-53, из замороженного глицеринового запаса из доступной библиотеки РНК-интерференции на планшетах LB-агара, содержащих 50 мкг/мл карбенициллина и 12,5 мкг/мл тетрациклина, используя трехфазную схему полос. Выращивайте бактерии при температуре 37 °C в течение ночи. Этот клон позволяет IPTG-зависимой продукции lin-53 дцРНК в бактериях.
      1. Кроме того, выращивайте РНК-интерференционные бактерии, которые содержат плазмиду L4440 без какой-либо последовательности генов в качестве пустого векторного контроля.
   3. На следующий день выберите одну колонию из lin-53 или пустых векторных планшетов LB-агара с помощью наконечника для пипетки объемом 200 μL и инокулируйте каждую из них в отдельную культуральную пробирку, содержащую 2 мл жидкой среды LB с добавлением 50 μг/мл карбенициллина. Выращивайте культуры в течение ночи при 37 °C до тех пор, пока они не достигнут оптической плотности (OD) при 600 нм 0,6 – 0,8. Измерьте внешний диаметр с помощью спектрофотометра.
      ВНИМАНИЕ: Жидкая среда LB не должна содержать тетрациклин, в отличие от пластины LB-агара, используемой для удаления бактерий из глицеринового запаса, поскольку включение тетрациклина во время кормления приводит к снижению эффективности РНК-интерференции.
   4. Добавьте 500 μL каждой бактериальной культуры (lin-53 или пустой вектор) на 6-сантиметровые пластины NGM-Agar RNAi с помощью мультипипетки. Инкубируйте тарелки с закрытой крышкой на ночь при комнатной температуре в темноте до просушки. В течение этого времени IPTG в планшетах NGM будет индуцировать выработку дцРНК в бактериях.
      1. Используйте не менее 3 планшетов на бактериальную культуру в одном эксперименте. Это обеспечит 3 технических повтора для каждого эксперимента.
   • Хранить высушенные пластины NGM-агара РНК-интерференции с бактериями при температуре 4 °C в темноте до двух недель.
3. Приготовление штамма C. elegans BAT28
4. Поддерживайте штамм червей BAT28, содержащий трансгены otIs305 [hsp-16.2prom::che-1, rol-6(su1006)] и ntIs1 [gcy-5prom::gfp] на бактериях OP50, используя стандартные планшеты NGM-Agar при 15 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Подробный протокол по культивированию нематод см. в разделе. rol-6(su1006) является доминирующим аллелем и широко используемым фенотипическим инъекционным маркером¹⁶, который вызывает типичное движение качения. Он используется в трансгене otIs305 для отслеживания hsp-16.2prom::che-1.
   1. Постоянно держите штамм BAT28 при температуре 15 °C, чтобы предотвратить предупредительную активацию трансгена hsp-16.2prom::che-1. Уменьшите воздействие температур выше 15 °C, максимально обрабатывая при этом нагрузку.
5. Чтобы синхронизировать возраст червей, используйте технику отбеливания.
   1. Смыть 6 см пластины NGM-Agar, содержащие взрослых особей и яйца BAT28, используя буфер M9 объемом 900 мкл. Гранулированные черви центрифугированием при 900 x g в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость.
   2. Добавьте 0,5 – 1 мл отбеливающего раствора и встряхивайте пробирку примерно 1 минуту, пока взрослые черви не начнут лопаться. Мониторинг осуществляется с помощью стандартного стереомикроскопа.
   3. Гранулируйте червей центрифугированием при 900 х г в течение 1 мин. Удалите надосадочную жидкость.
   4. Промойте гранулу червяка 3 раза, добавив 800 μL буфера M9 и центрифугируя при 900 x g.
   5. Выложите очищенные яйца на свежие NGM-тарелки, засеянные бактериями OP50. Выращивайте обесцвеченную популяцию на бактериях OP50 при 15 °C до тех пор, пока они не достигнут стадии L4 (примерно 4 дня). Личинки L4 могут быть распознаны по белому пятну примерно на полпути вдоль вентральной стороны червя с помощью стандартного стереомикроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы достичь фенотипа превращения зародышевой клетки в нейрон при истощении lin-53, он должен быть истощен в родительском поколении (P0). Оценка конверсионного фенотипа проводится в следующем поколении (дочернее поколение F1). Для достижения истощения lin-53, уже находящегося в P0, животных L4 подвергают воздействию РНК-интерференции.
6. Вручную перенесите 50 червей стадии L4 на репликацию с помощью платиновой проволоки на планшет NGM, который не содержит бактерий, и позвольте червям отойти от любых перенесенных бактерий OP50. Дайте червям пошевелиться по тарелке около 5 минут. Используйте бактерии из пластин NGM-Agar RNAi, ранее засеянных бактериями lin-53 RNAi (или пустой векторный контроль), для переноса на соответствующие пластины РНК-интерференции.
   1. Избегайте переноса бактерий OP50 на настоящие РНК-интерференционные планшеты. Работайте быстро, чтобы свести к минимуму время воздействия штамма на температуру выше 15 °C.
7. Инкубируйте червей на пластинах NGM-Agar RNAi при 15 °C в течение примерно 7 дней, пока потомство F1 червей не достигнет стадии L3 – L4. Их можно четко отделить от животных P0, поскольку они крупнее и толще, чем потомство F1.
   1. Визуально проверьте под стандартным стереомикроскопом, демонстрирует ли потомство червей F1 фенотип выступающей вульвы (pvul), как показано на рисунке 1. РНК-интерференция против lin-53 обладает плейотропными эффектами и вызывает фенотип pvul, который может быть использован для оценки успешности РНК-интерференции против lin-53><. ПРИМЕЧАНИЕ: РНК-интерференция против lin-53 также может вызывать летальность эмбрионов F1. Этот эффект усиливается, если планшеты подвергаются воздействию более высоких степеней, чем 15 °C, до того, как животные достигнут стадии L3 – L4. Мертвые эмбрионы можно распознать по задержке развития и отсутствию вылупления.
   2. Инкубируйте планшеты в темноте, так как IPTG чувствительна к свету.

Результаты

Рисунок 1: Фенотип Pvul, вызванный РНК-интерференцией против lin-53. (Вверху) ДВС-картина потомства L4/молодых взрослых червей стадии F1, полученных от матерей контрольной группы или матерей, получавших РНК-интерференцию lin-53. Масштабные линейки = 20 мкм. (внизу) Животные, обработанные лин-53 РНК-интерференцией, демонстрируют фенотип выступающей вульвы (pvul) (черные стрелки)...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Химикаты
Агар-Агар, Кобе I	Рот	5210.1
Бактопептон	А. Хартенштайн ГмбХ	Телефон: 211 677	Пептоновые среды
Дрожжевой экстракт	АпплиХим	А1552,0100
амфотерицин B	USBиология	А2220
CaCl2	Merck Biosciences	No 208290
Холестерин	Рот	8866.2
Желатин	Рот	4275.3 Кабельный номер 4275.3
IPTG	сигма	15502-10Г
K2PO4	Рот	Т875.2
Рот	3904.2
MgSO4	ВВР	25 163 364
Na2HPO4	Рот	П030.1
NaCl	Рот	9265.1 Телефон 9265.1
NaClO	Рот	9062.3
NaOH (5 N)	Рот	КК71.1
Tris	Рот	АЕ15.2
Карбенициллин	Рот	634412
Тетрациклин	Рот	2371.2 Материал 2371.2
Инкубаторы
Инкубатор	Саньо МИР-5	5534210	для поддержания штаммов червей при температуре 15 °C или 25 °C
Микроскопы
Стереомикроскоп	СМЗ745	Компания Nikon
Штаммы бактерий
Escherichia coli HT115			F-, mcrA, mcrB, IN(rrnD-rrnE)1, rnc14::Tn10(DE3 лизоген: lavUV5promoter -T7 polymeraза) (IPTG-индуцируемая Т7 полимераза) (RNAseIII минус).
Escherichia coli OP50			Штамм Uracil auxotroph E. coli
Штаммы червей
BAT28: otIs305 (hsp16.2prom::che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom::gfp) V.			получен от OH9846 в 4 раза больше обратного скрещивания с N2
RNAi
ИсточникБионаука	Идентификационный номер I-4D14	Библиотека Ahringer 16B07 ChromI, K07A1.12
пустой ветор: L4440	Адджен	#1654

<тр > <тр > Кабель <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > Кабель <тр > <тр > <тр > <тр > <тд >KH2PO4 Кабель <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > <тр > Клоны <тр > <ТД >ЛИН-53 <тр >