Кормление РНК-интерференцией в жидкой культуре: высокопроизводительный метод подавления экспрессии генов у C. elegans

Аннотация

Источник: Groh, N. et al. Методы изучения изменений в агрегации присущих белка с возрастом у Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

РНК-интерференция - это мощный генетический инструмент, доступный исследователям C. elegans. В этом видео представлен метод лечения большего числа червей с помощью РНК-интерференции, чем при кормлении планшетами, с использованием жидких условий культивирования.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Groh et al, Методы изучения изменений в агрегации присущих белков с возрастом у Caenorhabditis elegans, J. Vis. Exp. (2017).

1. Жидкая культура животных без гонад для сбора молодых и старых животных, подвергшихся воздействию РНК-интерференции, нацеленной на интересующий ген

ПРИМЕЧАНИЕ: Реакция некоторых генов на РНК-интерференцию может зависеть от температуры, как описано ранее. В качестве альтернативы РНК-интерференции мутантный ген может быть включен в фон gon-2(-).

1. Подготовка бактерий к жидкой культуре
   1. Подготовьте бактерии OP50 и РНК-интерференции (бактерии, продуцирующие желаемую дцРНК, и бактерии с пустым вектором в качестве контроля) путем инокуляции 4 л LB-среды 12 мл соответствующей бактериальной культуры (добавьте конечную концентрацию 50 мкг/мл карбенициллина и 1 мМ IPTG к бактериальным культурам РНК-интерференции) и инкубируйте их при 37 °C в течение ночи при 180 об/мин.
   2. На следующий день соберите культуры при концентрации 6 700 x g в течение 10 мин при 4 °C. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте каждую гранулу в 60 мл ледяной базальной среды S (100 мМ NaCl, 50 мМ фосфата калия pH 6, хранящейся на льду). Храните три ресуспендированные гранулы (OP50, контрольные РНК-интерференционные бактерии и РНК-интерференционные бактерии для интересующего гена) при температуре 4 °C до шага 1.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Червей можно выращивать на РНК-интерференции со стадии L1 или во избежание дефектов развития с последней личиночной стадии L4 (см. шаг 1.2).
2. Жидкая культура для обработки РНК-интерференцией, начиная с последней личиночной стадии L4
   1. Добавьте 200 мл S базальной среды в колбу для культуры Fernbach (емкость 2 800 мл). Для конечного объема культуры 300 мл (см. 1.2.2.4) добавьте 10 мМ цитрата калия, pH 6, 3 мл раствора микропримесей металлов (5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), 2,5 мМ FeSO₄, 1 мМ MnCl₂, 1 мМ ZnSO₄, 0,1 мМ CuSO₄), 3 мМ MgSO₄, 3 мМ CaCl₂, 100 нг/мл карбендазима и 5 мкг/мл холестерина). Закройте колбу мембранной завинчивающейся крышкой. Рецепты буферов приведены в таблице 1.
   2. Извлеките L1 из температуры 25 °C и перенесите их в пробирки объемом 15 мл. Центрифугируйте при давлении 1 900 x g в течение 3 мин, удалите надосадочную жидкость и подсчитайте L1 на 2 мкл. Добавьте 500 000 L1 в колбу для культуры Fernbach, приготовленную на предыдущем этапе.
   3. Добавьте OP50 (из шага 1.1) пропорционально количеству червей. Например, для 500 000 червей добавьте 60 мл OP50.
   4. Полный посев червей с S базальным, чтобы довести общий объем до 300 мл. Инкубируйте культуру червей до стадии L4 при 25 °C в встряхивающем инкубаторе со скоростью вращения 150 об/мин.
   5. На следующий день черви должны быть размером с L4 дикого типа. Чтобы перейти с OP50 на РНК-интерференционные бактерии, соберите животных в шесть 50-мл-пробирок, дайте им отсадиться и удалите надосадочную жидкость. Промойте L4s M9 для удаления остатков бактерий OP50: центрифугируйте при 1900 x g в течение 3 минут, удалите надосадочную жидкость и перенесите все L4 в одну 50 мл-пробирку. Подсчитайте L4 на 5 μл (не менее девяти раз). В два раза требуется 50 000 L4 для коллекции молодых червей и в два раза 100 000 L4 для коллекции старых червей.
   6. Подготовьте четыре колбы для культуры Фернбаха, как описано в пункте 1.2.2.1. Добавьте также конечную концентрацию 50 мкг/мл карбенициллина и 1 мМ IPTG в каждую колбу.
   7. Добавьте контрольные РНК-интерференционные бактерии и РНК-интерференционные бактерии для интересующего гена (из шага 1.1) пропорционально количеству червей: добавьте 7 мл соответствующих бактерий на колбу для молодых червей и 14 мл на колбу для старых червей.
   8. Добавьте 50 000 червей в колбу для коллекции молодых червей и 100 000 червей в колбу для коллекции старых червей и дополните культуры базалом S, чтобы заполнить до 300 мл. Инкубируйте культуры червей (всего четыре) при температуре 25 °C и 150 об/мин.

2. Содержание жидких культур C. elegans

1. Периодически собирайте аликвоту из каждой жидкой культуры и помещайте на предметное стекло (или на агаровую пластину), чтобы убедиться в отсутствии загрязнений. С помощью диссекционного микроскопа проверьте уровень бактериальной пищи в культуре, особенно в фазе роста. Заранее подготовьте 2 л культур контрольных РНК-интерференционных бактерий и РНК-интерференционных бактерий для интересующего гена, как описано в шаге 1.1. При необходимости добавьте их в жидкие культуры C. elegans, а остальное держите при температуре 4 °C.
2. Периодически проверяйте стерильность животных. У большинства животных не будет гонады. В зависимости от пенетрантности мутации gon-2, у некоторых из них могут быть абортированные гонадные структуры, но животных с яйцами наблюдать не следует.

Стоковое решение	количество	Конечная концентрация	Комментарии/Описание
S базальный (для 500 мл: 5,9 г NaCl, 50 мл 1 М Фосфат калия pH 6)	200 мл		1 м Калийфосфат pH 6: На 1 л: 129 г KH2PO4 моноосновный, 52 г K2HPO4 двухосновного безводного
1 М цитрат калия pH 6 (Для 400 мл: 13,1 г моногидрата лимонной кислоты, 134,4 г моногидрата три-цитрата калия)	3 мл	10 мМ
Раствор микропримесей металлов (На 1 л: 1,86 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА),<бр/> 0,69 г FeSO4 · 7 H2O, 0,2 г MnCl2 · 4 H2O, 0,29 г ZnSO4 · 7 H2O, 0,025 г CuSO4 · 5 H2O)	3 мл		Хранить стоковый раствор в темноте при температуре 4 °C
1 М MgSO4 (для 500 мл: 123,3 г)	900 мкл	3 мМ
1 М CaCl2 (для 500 мл: 73,5 г)	900 мкл	3 мМ
200 μг/мл Карбендазим<бр/> (Для 50 мл: 10 мг в метаноле)	150 мкл	100 нг/мл
5 мг/мл холестерина (Для 100 мл: 0,5 г этанола)	300 μл	5 мкг/мл

Таблица 1.

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Колба для культуры Фернбаха	Корнинг	4425-2XL	Pyrex, емкость 2 800 мл, с 3 отступами перегородки	да
Мембранный завинчивающийся колпачок	Шотт	1Э+06	ГЛ45	да
Смеситель для нутации	ВВР	444-0148		да
Разделительная воронка	Налген	4300-1000	Емкость 1 000 мл	Нет
1 мл шприц	БД Пластипак	3Э+05		Нет
Игла серая, 27 G x 1/2", 0,4 мм x 13 мм	BD Microlance 3	3Э+05		Нет
Мембранные фильтры 0,025 μМ	Многородность	VSWP04700		Нет
pH-полоска	Мачери-Нагель	92110	pH-фиксация 0-14	Нет
Коктейль ингибиторов протеазы	Рош	5Э+09	Полноценные таблетки Mini без ЭДТА	Нет
Октоксинол-9	Апплименем	А1388	Тритон Х-100	Нет
4-Морфолинэтансульфоновая кислота (MES)	Сигма-Олдрич	М1317		Нет
Нонилфенилполиэтиленгликоль	Апплименем	А1694	Нонидет П40 (NP40)	Нет
ДНКазаИ	Рош	5Э+09	рекомбинантный, не содержит РНКазы	Нет
РНКаза	Компания Promega	А7973	решение	Нет
Окрашивание общим белком-блоттингом	Термофишер	С11791	Sypro Ruby Protein Blot пятно	Нет
Окрашивание гелем с общим белком	Термофишер	С12001	Сипро Рубиновый протеиновый гелевый краситель	Нет
TCEP (трис (2-карбоксиэтил) фосфин гидрохлорид)	Серва	No 36970 (Английский		Нет
Йодоацетамид	Серва	No 26710		Нет
Бикарбонат аммония	Сигма-Олдрич	9830		Нет
Секвенирование модифицированного трипсина	Компания Promega	В5111		Нет
Изобарические метки для относительного и абсолютного количественного определения	Sciex	4Э+06	Мультиплексный набор реагентов iTRAQ	Нет
Центрифуга Avanti J-26XP	Бекман Коултер	4Э+05		да
Ультрацентрифуга Optima Max-XP	Бекман Коултер	4Э+05		Нет
Центрифуга 5424R	Эппендорф	5Э+09		да
Центрифуга 5702	Эппендорф	6Э+09		да
Центрифуга Megafuge 40R	Термо Сайентиал	8Э+07		Нет
Концентратор Плюс	Эппендорф	5Э+09	Центробежный испаритель	Нет
Флуоресцентный стереомикроскоп M165 FC	Лейка		С целью Planapo 2.0x	Нет
Диссекционный микроскоп	Лейка		Leica S6E	да
Микроскоп с большим увеличением Zeiss Axio Observer Z1	Цейсс		С объективом PlanAPOCHROMAT 20x и Zeiss Axio Cam MRm	Нет
программное обеспечение				Нет
Программное обеспечение для анализа изображений	ИзображениеJ			Нет
Анализ данных масс-спектрометрии	Белковый разведчик		http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm	Нет
Штаммы кишечной палочки
ОП50	КГК
РНК-интерференционные бактерии
Л4440	Библиотека РНК-интерференции Джули Арингер
Мутанты C. elegans
КФ2253	CGC, название штамма: EJ1158		Генотип: gon-2(q388)
Трансгенные препараты C. elegans
ДКД214	Лаборатория Деллы Давида в DZNE Tübingen		Генотип: N2; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]
ДСД215	Лаборатория Деллы Давида в DZNE Tübingen		Генотип: daf-2(e1370) III; uqIs24[Pmyo-2::tagrfp::p ab-1]

Кабель ) шт.