Четырехсторонний ольфактометрический анализ: метод оценки реакций на запах у дрозофил

Аннотация

Источник: Lin, C.C., et al. Обонятельное поведение, измеренное с помощью компьютерного слежения за дрозофилой в четырехквадрантном ольфактометре. J. Vis. Exp. (2016).

Плодовые мушки имеют сложную обонятельную систему, могут различать сотни запахов и использовать свое обоняние для принятия поведенческих решений. В этом видео описывается четырехсторонний ольфактометрический анализ, метод изучения обонятельных поведенческих реакций у мух. В ролике с протоколом показано, как работать с тестовыми мухами и какие шаги являются критическими при проведении анализа.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Lin et al., Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer, J. Vis. Exp. (2016).

1. Поведенческие реакции на привлекательные и отталкивающие запахи

1. Включите регулятор температуры и установите его на 25 °C.
2. Подсоедините камеры одоранта (контрольные и тестовые одоранты), вставив трубку в выходное отверстие камеры одоранта и в штуцер push-to-connect на поведенческой коробке.
3. Проверьте расход в каждом квадранте с помощью расходомера, чтобы убедиться, что потоки воздуха для управления и одоранта равны 100 мл/мин.
4. Очистите арену из ПТФЭ и стеклянные пластины 70% этанолом 2-3 раза и дайте им полностью высохнуть на воздухе (~3-4 минуты).
5. Прикрепите стеклянные пластины к арене с помощью хомутов.
6. Перенос мух без анестезии CO₂ в арену через отверстие в одной из стеклянных пластин. После переноса поместите круглую сетку на отверстие, чтобы предотвратить побег мух.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Было показано, что анестезия CO₂ влияет на поведение дрозофил и не должна использоваться в течение 24 часов после поведенческого эксперимента.
7. Поместите арену с мухами в светонепроницаемую камеру, подключите четыре потока управляющего воздуха, подсоединив трубку, прикрепленную к фитингу push-to-connect на поведенческом боксе, к углам арены, закройте дверцу камеры и подождите 10-15 минут, чтобы мухи акклиматизировались к новой среде. По возможности выключите свет в комнате, где проводятся эксперименты, чтобы избежать возможной минимальной утечки света, которая может повлиять на результат эксперимента.
8. Проведите контрольный эксперимент продолжительностью 5-10 минут, в котором мухи подвергаются воздействию 4 контрольных потоков воздуха.
9. Немедленно проанализируйте данные (см. раздел «Анализ данных» ниже), чтобы убедиться, что мухи распределены равномерно на арене, а индекс привлекательности близок к 0. Этот шаг имеет важное значение, так как он проверяет отсутствие неконтролируемых источников предпочтения или избегания на арене (например, утечка света извне, неравномерное распределение температуры, неравномерное распределение арены, загрязнение запахом и т. д.). Если мухи распределены неравномерно или их локомоторная активность низка, выбросьте мух, снова очистите арену (шаг 1.4) и используйте новую партию мух для повторения эксперимента.
10. Подключите испытательную камеру одоранта к установке, включив 3-ходовые клапаны или повторно засоединив соединительные трубки.
11. Проведите тестовый эксперимент в течение 5-10 минут и проанализируйте данные, как описано в разделе 2 ниже (Рисунок 1). Записи продолжительностью более 20 минут могут привести к созданию файлов данных, которые могут быть затруднены для вычислительной обработки. Если требуется более длительная экспериментальная запись, быстро остановите и перезапустите программу слежения. Это приводит к разрыву между экспериментальными записями ~10 секунд.
12. Выбросьте мух.
13. Очистите арену и стеклянные пластины 70% этанолом (шаг 1.4) и замените соединительные трубки внутри светонепроницаемого корпуса. Чтобы ускорить эксперименты, можно использовать новую чистую арену, а грязную арену очищать во время выполнения экспериментальных заездов.
14. Проведите еще один эксперимент с новой партией мух, если это необходимо. Если в один и тот же день проводится несколько экспериментов, будьте предельно осторожны, чтобы убедиться, что в системе не осталось одоранта от предыдущего тестового прогона. Обычно это не является проблемой при низких концентрациях одорантов или при_CO2, но для высококонцентрированных стимулов может потребоваться интервал до 24 часов между экспериментальными прогонами. Кроме того, все трубки после проточных трубок могут быть заменены, если в ходе контрольных экспериментов есть подозрение на загрязнение одоранта. Всегда оставляйте сухой воздух включенным между экспериментами, чтобы непрерывно продувать систему.

2. Анализ данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Предлагаемое программное обеспечение для отслеживания мух (подробно описано в разделе Материалы), отслеживает полеты в реальном времени во время захвата, а также сохраняет временную метку и координаты всех обнаруженных полетов в формате *.dat. Мы разработали специальную процедуру Matlab для преобразования данных в формат Matlab и анализа данных. Примеры кода приведены в Дополнительных материалах, но детали реализации будут зависеть от программного обеспечения, используемого для сбора данных.

1. Загрузите исходные данные. Создайте пространственную маску, которая повторяет контуры арены, и примените маску к необработанным данным, чтобы удалить все точки данных, которые находятся за пределами арены, поскольку они представляют шум (Рисунок 2A, дополнительный код MaskSpatialFiltering.m, Score.m, DrawCircularMask.m).
2. Удалите все точки данных, которые движутся со скоростью ниже 0,163 см/с дольше 3 с, так как эти данные, скорее всего, будут представлять собой шум или создаваться недвижущимися мухами (Рисунок 2B, дополнительный код TemporalFiltering.m).
3. Визуализируйте оставшиеся точки данных, нанеся их на график сразу или в виде отдельных траекторий (Рисунок 1, дополнительный код SingleTrajectoryViewer.m).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Расположение границ запаха в четырех полях, вероятно, зависит от ряда факторов, таких как характеристики каждого одоранта и скорость используемого воздушного потока. Например, высоколетучие одоранты, скорее всего, заполнят сектор запаха более полно, чем менее летучие одоранты. Таким образом, вполне вероятно, что каждый одорант может проявлять несколько разные границы запаха. Использование фотоионизационного детектора для измерения границ запаха может быть проблематичным, поскольку он использует вакуум для отбора проб воздуха из определенного места, что нарушает концентрацию одоранта в этом месте. Тем не менее, границы запаха можно быстро оценить на основе поведенческих данных мух. Например, граница запаха, основанная на накопленных следах мухи в ответ на различные запахи, может быть четко прослежена в Рисунок 1C и 1D.
4. Рассчитайте индекс притяжения, чтобы определить, не вызывают ли контрольные эксперименты реакцию предпочтений, а также получить доступ к реакции на одорантный (или оптогенетический) стимул. Чтобы рассчитать индекс притяжения (AI), используйте последние 5 минут контрольной или тестовой записи. Чтобы получить меру притяжения, которая находится в диапазоне от +1 (абсолютное притяжение) до -1 (абсолютное отталкивание), для вычисления AI используется следующая формула:
   
   где N_{критерий} — количество точек данных в тестовом квадранте, N_control — среднее количество точек данных в трех контрольных квадрантах. Эта мера интуитивно понятна, так как никакие предпочтения не будут обозначены околонулевыми значениями. Однако в нем неверно указывается доля от общего числа мух, которые находятся в квадранте одоранта. Для получения этого показателя можно использовать процентный индекс (PI):
   
   где N_{критерия} — количество точек данных в тестовом квадранте, а N_всего — общее количество точек данных во всех четырех квадрантах. Эта формула дает меру, которая находится в диапазоне от 0 до 1, где 0,25 соответствует отсутствию поведенческих предпочтений (Рисунок 1E и 2C, дополнительный код AttractionIndex.m).
5. Выполните 5-10 повторов каждого экспериментального условия, используя новую группу мух для каждого повтора. Сравните индексы притяжения между условиями или с контрольной группой с помощью непараметрического теста Колмогорова-Смирнова (функция Figure 1F, kstest2 в Matlab).

Результаты

Рисунок 1: Пример данных, полученных с помощью четырехпольного обонятельного анализа. (А) Схема арены с четырьмя полями. (В) Нейтральные реакции наблюдаются, когда все четыре квадранта содержат только перфузию сухого воздуха. (В) Реакция притяжения на 6,25% разведение яблочного уксуса, перфузионного из левого верхнего квадранта. (D) Отталкивающие свойств...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Система подачи воздуха			(Необходимое количество)
Трубки и соединители
Термопластичные коллекторы NPT(F)	Коул-Пармер, Иллинойс, США	Р-31522-31	1
Шестигранная редукционная соска (1/4MNPT->1/8MNPT)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5232Т314	1
Трубки (ID:1/8)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5108К43	50 футов
Трубки (ID:1/16)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	52355К41	100 футов
Фитинги из колючих труб	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5117К71	1 упаковка
Трубные обжимные фитинги с нажимным соединением	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5779К102	4
Фитинги с колючими трубками (1/4MNPT->1/8BF)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5463К439	1 упаковка (10)
Фитинги с колючими трубками (1/8MNPT->1/8BF)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5463К438	2 упаковки (10)
Фитинги с колючими трубками (1/8MNPT->1/16BF)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5463К4	2 упаковки (10)
Фитинги с колючими трубками (1/4MNPT->1/4BF)	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	5670К84	1
Заглушка с шестигранной головкой	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	48335К152	1
Регулятор давления воздуха, воздушный фильтр и расходомеры			(Необходимое количество)
Лабораторная газоосушительная установка	W A HAMMOND DRIERITE CO LTD, ОГАЙО,	Модель: L68-NP-303; артикул #26840	1
Многотрубные рамы для проточных труб 150 мм	Коул-Пармер, Иллинойс, США	Р03215-30	1
Многотрубные рамы для проточных труб 150 мм	Коул-Пармер, Иллинойс, США	Р03215-76	1
Проточные трубы 150 мм	Коул-Пармер, Иллинойс, США	Р-03217-15	9
Картридж клапана	Коул-Пармер, Иллинойс, США	Р-03218-72	9
Прецизионный регулятор воздуха	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	6162К13	1
Электромагнитные клапаны	Автоматизация науки, Беркли, Калифорния	02-10i	4
Электромагнитный контроллер клапана	ValveLink 8.2, Automate Scientific, Беркли, Калифорния	18-янв	1
Электронный расходомер	Ханивелл	AWM3100V	1
DAQ (NI USB-6009, Национальные инструменты) и	Национальные инструменты	NI USB-6009	1
электропитание	Инструменты Extech	No 382200	1
Камеры для запаха
Полипропиленовая банка с широким горлышком, 2 унции; 60 мл	Налген	562118-0002	Для каждого эксперимента требуется не менее 5 таких камер, но для каждого разведения каждого одоранта требуется отдельная камера. Доступно в Container Store, часть #635114)
Стеклянная камера для запаха, 0,25 унции	Бутылка Sunburst	ЛБ4Б	На эксперимент требуется не менее 5
"Входной" клапан для камеры запаха	Smart Products, Inc., Калифорния, США	214224ПБ-0011С000-4074	1 из этих частей используется в каждой камере запаха, но они нуждаются в частой замене
"Выходной" клапан для камеры запаха	Smart Products, Inc., Калифорния, США	224214ПБ-0011С000-4074	1 из этих частей используется в каждой камере запаха, но они нуждаются в частой замене
Уплотнительное кольцо	RT Dygert International, Миннесота, США	AS568-029 Буна-Н О-Р	1 упаковка (100)
Арена для полетов, камера и поведенческие боксы			(Необходимое количество)
Поведение и материал коробки камеры	Interstate plastics, Калифорния, США	АБС черный экструдированный (https://www.interstateplastics.com/Abs-Black-Extruded-Sheet-ABSBE~~ST.php)	1803 кв. дюйм
Тефлон для вставок для нахлыстовой арены и камеры запаха, толщина 3/8", 12" x 12"	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	8545К27	1
Стеклянные пластины, толщина 1/8 дюйма, 9 x 9 дюймов	Макмастер-Карр, Иллинойс, США	8476К191	2
Термоэлектрический контроллер двойного действия	WAtronix Inc, Калифорния, США	ДА12В-К-0	1
Инфракрасная светодиодная матрица	Advanced Illumination, Рочестер, Вермонт, США	AL4554-88024, PS24-TL	2 светодиодных массива и один блок питания
Блок кондиционирования воздуха	Магазин Melcor	MAA280T-12	1
Система визуализации			(Необходимое количество)
Объектив Cosmicar/Pentax C21211TH (12,5 мм F/1,4) с байонетом C	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, НЬЮ-ЙОРК,	PEC21211 КП	1
Соединительный кабель CCXC-12P05N	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, НЬЮ-ЙОРК,	SOCCXC12P05N	1
Адаптер для камеры DC-700	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, НЬЮ-ЙОРК,	SODC700	1
B+W 40,5 093 ИК фильтр	B AND H PHOTO AND ELECTRONICS CORP, НЬЮ-ЙОРК,	65-072442 (Английский	1
TiFFEN 40,5 мм Круговой поляризатор	амазонка		1
ИК-видеокамера	Industrial Vision Source, Флорида, США	Sony XC-EI50 (SY-XC-E150)	1
USB-конвертер видео	The Imagingsource, Северная Каролина, США	DFG/USB2-IT	1
iFlySpy2 (программное обеспечение для отслеживания мух)	Джулиан Браун, Стэнфорд, Калифорния: julianrbrown@gmail.com	Шпион iFlySpy2	1
Программное обеспечение для захвата микросхем	The Imagingsource, Северная Каролина, США	(http://www.theimagingsource.com/)
смешанный			(Необходимое количество)
Поворотный инструмент Dremel	Дремель, Расин, Висконсин, США	Дремель 8000-03	1
Алмазные сверла для резки стекла	Доступны от различных поставщиков; MSC Industrial Supply Co, Мелвилл, штат Нью-Йорк	90606328	1