дрозофила Y-образный лабиринт: метод оценки обонятельных реакций у мух

Аннотация

Источник: Simonnet, M. M., et al. Тестирование обоняния дрозофилы с помощью анализа Y-образного лабиринта. J. Vis. Exp. (2014).

В этом видео описывается метод проверки обонятельного исследовательского поведения плодовой мушки, называемый Y-образным лабиринтом. В представленном ролике с протоколом показано, как настроить и провести анализ.

Протокол

Этот текст протокола представляет собой выдержку из работы Simonnet et al., Testing Drosophila Olfaction with a Y-maze Assay, J. Vis. Exp. (2014).

1. Перед началом

работы

1. Используйте изогенизированный эталонный материал, несущий стабильные и устойчивые поведенческие фенотипы. Общего правила выбора этого подвойа не существует, так как все потенциальные контрольные группы могут нести гетерогенные фоновые аллели.
2. Используйте эту контрольную деформацию для обратного скрещивания всех остальных материалов, необходимых для последующих шагов. Этот шаг обратного скрещивания обычно представлен по меньшей мере 5 последовательными скрещиваниями одной девственной самки (чтобы обеспечить возможный кроссинговер между гомологичными хромосомами) с 2-3 изогенными эталонными самцами. Этот шаг важен для гомогенизации генетического фона между различными популяциями мух.
3. Поддерживайте запасы дрозофилы на стандартной кукурузной муке (9%), дрожжах (10%) и агаровой среде (1,5%) в сочетании с антибиотиком (0,4% метилпара-гидроксибензоата) в 12-часовом цикле свет/темнота при температуре 25 °C.
4. Проводите хемосенсорные эксперименты в помещении с контролируемой температурой (25 °C) при дальнем красном свете (чтобы исключить вклад визуальных сигналов и сосредоточиться на хемосенсорных сигналах). Регулярно обновляйте воздух помещения, чтобы проветривать помещение между каждым экспериментом.

2. Обонятельная реакция с использованием анализа Y-образного лабиринта

1. Перед испытанием мух заморочили в течение 16–18 часов при температуре 25 °C в стеклянных пробирках, содержащих влажное бумажное полотенце.
2. Соедините Y-образный соединитель с двумя стеклянными флаконами и с пластиковым флаконом меньшего размера (загрузочным флаконом). Используйте наконечники для пипеток объемом 1 мл, которые проходят через поролоновые пробки, чтобы соединить разъем с тремя флаконами и получить плотно закрытый Y-образный лабиринт. Отрежьте узкие концы двух наконечников для пипеток (диаметром ~2 мм, чтобы избежать возвращения мухи после принятия решения), чтобы сформировать два флакона-ловушки, и большой конец одного наконечника для пипетки, чтобы сформировать «загрузочную» трубку (Рисунок 1A).
3. Непосредственно перед соединением флаконов-ловушек (Рисунок 1B) поместите в каждый флакон по одной фильтровальной бумаге диаметром ~6 мм. Добавьте 40 μл раствора одоранта на одну фильтровальную бумагу и 40 μл соответствующего растворителя на вторую фильтровальную бумагу.
4. Введите десять мушек от 4 до 9 дней в «загрузочный» флакон. Не используйте анестезию CO₂ во время этой пересадки, так как она оказывает сильное влияние на поведение. Лучше используйте кратковременное охлаждение на льду. Правильное обращение с мухами под наркозом важно для максимального ограничения стресса у субъектов.
   1. Проведите серию тестов Y-образного лабиринта при температуре 25 °C при дальнем красном свете (используя светодиодные лампы для ограничения возможного источника тепла), чтобы по возможности избежать визуальных стимулов. Будьте осторожны при чередовании ориентации Y-образных лабиринтов (трубка, содержащая запах, слева или справа, и загрузочная трубка спереди или сзади; рисунок 1в).
   2. Подождите несколько часов, чтобы мухи проникли во флакон-ловушку, содержащую одорант или растворитель. Подсчет мух через 24 часа для увеличения участия до более чем 80% и обеспечения максимального значения обонятельного индекса (Симонне, личное общение).
   3. Рассчитайте полученный обонятельный индекс по следующей формуле: (число в пробирке с запахом - количество в пробирке с растворителем)/общее количество загруженных мух.
5. Промойте установку Y-образного лабиринта следующим образом: замочите демонтированную установку в RBS 35 MD на ночь. Тщательно смойте водой из-под крана. Наконец, промойте деионизированной водой и дайте высохнуть.

3. Статистический анализ данных

1. Выполните t-критерий, однофакторный ANOVA или двусторонний ANOVA в зависимости от данных и переменных.

Результаты

Рисунок 1: Мужская обонятельная реакция оценена с помощью установки Y-образного лабиринта. А) Сплит-устройство. Б) Собранное устройство. В) Установка в рабочем состоянии под дальним красным светом. D) Количественная оценка мужских обонятельных реакций на уксусную кислоту (АК) или фенилуксусную кислоту (ПАА), разведенные в дистиллированной воде (10% v/v) ...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Трубка из полистирола дрозофилы	VWR Европа	734-2255	30 x 25 мм Y-образный лабиринт
Боросиликатная трубка дрозофилы	Дижон верре		95 X 25 мм Y-образный лабиринт
Поролоновая пробка	Датчер	999038	Y-образный лабиринт
Y-образный соединитель	Europrix	11020605	Y-образный лабиринт
Наконечники для пипеток объемом 100-1 000 мкл	Корнинг	4868	Присоедините следующие наконечники для пипеток к Y-образному разъему. Отрежьте 2 наконечника для пипетки на расстоянии 65 мм от широкого конца и соедините узкий конец (с отверстием ~2 мм) с 2 тестовыми флаконами. Эти отверстия ограничивают развороты, как только мухи попадут в трубки, содержащие запахи. Отрежьте 1 наконечник пипетки на расстоянии 35 мм от широкого конца, и подсоедините его к загрузочному флакону.
Дальняя красная светодиодная лампа	Рубин-Лакак	0РБ180238	625-630 нм
уксусная кислота	Сигма-Олдрич	No 45725
Фенилуксусная кислота	Сигма-Олдрич	П16621
дрожжи	Sensient Flavors Страсбург	1018880464
Кукурузной муки	Еврогерм	Farine de maïs
агар	Калис	НР-697-25
Метилгидроксибензоат 4	VWR международный	25605293