Этот протокол является выдержкой из Brust-Mascher and Scholey, Microinjection Techniques for Study Mitosis in the Drosophila melanogaster Syncytial Embryo, J. Vis. Exp. (2009).
Рецепты:
Тарелки с виноградным соком:
- 5,5 г бакто-агара
- 14,5 г декстрозы или глюкозы
- 7,15 г сахарозы
- 45 мл концентрата виноградного сока (100% сок).
- 204,5 мл H20
- 625 мкл 10N NaOH
Смешайте все ингредиенты и разогрейте в микроволновке до закипания.
Добавьте 2,8 мл кислотной смеси (смесь кислот: 20,9 мл пропионовой кислоты, 2,1 мл фосфорной кислоты, 27 мл H20)
Перемешайте и вылейте на 35 мм чашки Петри. Дайте застыть при комнатной температуре в течение одного-двух дней. Если пластины не будут использоваться в ближайшее время, закройте парапленкой и держите при температуре 4 °C (дайте сбалансироваться до RT перед использованием).
Дрожжевая паста:
Растворите около одной чайной ложки дрожжей (Sigma YSC2, дрожжи из Saccharomyces cerevisiae типа II) в воде до образования густой пасты. Нанесите небольшое количество этого на каждую тарелку с виноградным соком непосредственно перед использованием.
Буфер для инъекций:
- 150 мМ К-аспартат
- 10 мМ К-фосфат
- 20 мМ имидазола, pH 7,2
Гептановый клей:
Разверните двойную липкую ленту и поместите в бутылку объемом 100 мл, добавьте около 50 мл гептана, закройте бутылку и укачивайте на несколько дней. При использовании добавьте гептан, если клей слишком густой.
Камера обезвоживания:
Возьмите чашку Петри диаметром 100 мм, положите внутрь одну часть чашки диаметром 35 мм, чтобы получился «стол» и добавьте вокруг нее Дриерит (безводный сульфат кальция) так, чтобы высота Дриерита была не выше «стола» и крышки. Покровный лист с эмбрионами будет помещен на этот «стол» для обезвоживания перед инъекцией. Хорошей идеей будет использовать хотя бы некоторые указатели Дриерита и изменить его, когда он изменит цвет.
>Протокол:
Этот протокол может быть использован для введения практически любого растворимого реагента в синцитиальный эмбрион дрозофилы: например, либо флуоресцентного белка для наблюдения, либо ингибитора целевого белка, либо и того, и другого.
1. Сбор эмбрионов
- Поставьте новую тарелку для виноградного сока на клетку для кладки.
- Снимите эту пластину через час, это первый сбор за день и часто бывает не очень хорошо. От него можно отказаться.
- Меняйте пластину каждый час, чтобы продолжать собирать эмбрионы в течение одного часа каждая.
2. Подготовка покровного стекла
- Наденьте покровную крышку размером 50 x 22 мм на одну сторону предметного стекла микроскопа. Прикрепите четыре угла к предметному стеклу, чтобы он не двигался.
- С помощью аппликатора с ватным наконечником нанесите один слой гептанового клея в одну линию на покровный лист (клей не должен быть вязким и должен высохнуть за несколько секунд, в противном случае добавьте еще гептана).
- Наденьте кусок двойной липкой ленты на предметное стекло по направлению к боковой стороне покровного стекла.
3. Подготовка эмбрионов
ПРИМЕЧАНИЕ: Эмбрионы должны быть визуализированы примерно через 2 часа после начала сбора, поэтому начните следующие шаги, предоставив достаточно времени, чтобы закончить их в течение этого времени.
- Смоченной щеткой аккуратно соберите зародыши с пластины с виноградным соком и положите на двойную липкую ленту на предметное стекло.
- Используя внешнюю часть пинцета, прокатывайте эмбрионы по двойной липкой ленте до тех пор, пока хорион (внешняя оболочка) не разорвется.
- Возьмите эмбрион, осторожно прокатав его по хориону так, чтобы он прилип к пинцету, и поместите его на гептановый клей на покровном листе так, чтобы длинная сторона эмбриона была параллельна длинной стороне покровного стекла. Посадите от 10 до 20 эмбрионов в один ряд.
- Снимите покровное стекло и поместите его в камеру обезвоживания на 3-8 минут (это зависит от влажности в помещении и количества инъекционного стекла).
- Поместите на металлическую камеру с вакуумной смазкой.
- Накройте эмбрионы галоидоуглеродным маслом 700, чтобы избежать дальнейшего обезвоживания. Теперь эмбрионы готовы к инъекции.
4. Инъекция эмбриона
- Найдите эмбрионы с целью 16x.
- Отодвиньте эмбрионы и найдите иглу, не перемещая фокальную плоскость.
- Центрируйте иглу и перемещайте ее вверх, не перемещая ее в направлении x или y.
- Если игла не открыта, поставьте край покровного стекла в поле зрения, но не там, где будет игла, и опустите иглу в ту же фокальную плоскость. Очень осторожно перемещайте покровное стекло до тех пор, пока оно не попадет в иглу и аккуратно не разомнет ее. Если игла открыта, перейдите к шагу 5. (Иглы могут быть вскрыты фтористоводородной кислотой перед заполнением).
- Поместите эмбрионы в поле зрения (но не там, где будет игла), опустите иглу в масло и убедитесь, что вы получаете приятные жидкие капли из иглы.
- Осторожно, но неуклонно переместите эмбрион в иглу, введите каплю в эмбрион и отодвигайте эмбрион. (Или следуйте инструкциям вашего инъекционного аппарата).
- После того, как все эмбрионы были введены, они готовы к наблюдению на конфокальном микроскопе.
