Анализ световых пятен: метод исследования фототаксического поведения дрозофилы

Аннотация

Источник: Sun, Y., et al. Анализ на основе световых пятен для анализа фототаксиса личинок дрозофилы. J. Vis. Exp. (2019).

Личинки дрозофилы светочувствительны и реагируют на изменения окружающего света. В этом видео описывается анализ, который проверяет их способность избегать света, называемый анализом световых пятен. Представленный протокол демонстрирует, как настроить анализ с помощью синего светодиода, а также показывает, как записывать поведение животного в ответ на встречу со светом.

Протокол

Этот текст протокола является выдержкой из Sun et al., Light Spot-Based Assay for Analysis of Drosophila Larval Phototaxis, J. Vis. Exp.(2019).

1. Настройка системы визуализации

1. Зажмите веб-камеру с высоким разрешением железным зажимом примерно на 10 см выше светового пятна на рабочем столе (Рисунок 1).
2. Отрегулируйте ориентацию объектива камеры в сторону рабочего стола. Подключите камеру к компьютеру через USB-интерфейс.
3. Поместите агаровую пластину на рабочем столе прямо под камерой.
4. Откройте программу "Amcap9.22" на компьютере с Windows 7, и световое пятно автоматически отобразится в окне AMcap. Переместите камеру немного влево или вправо, чтобы световое пятно находилось рядом с центром окна. Следите за тем, чтобы фотокамера не загораживала путь света. Световое пятно должно быть полным и круглым.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Программное обеспечение можно найти по адресу http://amcap.en.softonic.com/.
5. Закрепите полосовой фильтр 850 нм ± 3 нм с зажимом на 5-7 мм прямо под камерой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Диаметр фильтра составляет около 2,5 см, а диаметр объектива камеры менее 1 см, поэтому фильтр может охватывать поле зрения камеры. При наличии фильтра под камерой световое пятно не должно быть видно в окне AMcap.
6. Разместите три светодиода, генерирующих инфракрасный свет (центральная длина волны = 850 нм), равномерно вокруг агаровой пластины. Каждый светодиод должен находиться на расстоянии около 5 см от края агаровой пластины, а лицевая сторона линзы светодиода должна быть под углом 70° вниз к агаровой пластине. Подключите светодиоды к источнику питания через преобразователь переменного тока в постоянный.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Лучше зафиксировать положение и углы инфракрасных светодиодов света, чтобы обеспечить постоянство яркости поля в различных экспериментальных испытаниях и облегчить последующую обработку видео.
7. Поместите черную доску между компьютером и устройством. Уменьшите яркость экрана компьютера так, чтобы свет экрана компьютера не влиял на эксперимент.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Держите окружающую среду темной при измерении длины волны или интенсивности света.

2. Настройка параметров визуализации

1. В меню программного обеспечения AMcap выберите «Параметры» | Видеоустройство | Формат захвата и установите размер пикселя захваченного видео на 800 x 600 и частоту кадров на 60 кадров в секунду.
2. Снимите фильтр из-под камеры, подложите линейку под камеру и отрегулируйте фокус камеры так, чтобы линия шкалы была четкой и параллельной ширине поля зрения видео.
3. Нажмите «Захват» | Настройка | Захват видео для выбора пути сохранения, нажмите «Начать запись», запишите фактическое расстояние, соответствующее 600 пикселям, и рассчитайте отношение каждого пикселя к фактическому расстоянию.

3. Видеозапись поведения при уклонении от света

1. Поддерживайте температуру 25,5 °C во всех экспериментах. При необходимости регулируйте температуру в помещении с помощью кондиционера. Поддерживайте влажность воздуха постоянно на уровне 60% с помощью увлажнителя воздуха.
2. Снимите короткое видео положения светового пятна с именем "lightarea1". Затем переместите фильтр с длиной волны 850 нм ± 3 нм назад, чтобы закрыть объектив камеры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При записи поведения личинок объектив камеры закрывается фильтром 850 нм ± 3 нм, чтобы световое пятно не отображалось на видео. Световое пятно можно реконструировать на видео с личинками позже с помощью Matlab. Не изменяйте положение камеры и избегайте изменения отношения каждого пикселя к фактическому расстоянию, измеренному на шаге 2.3.
3. Включите свет (т. е. комнатный свет) вдали от экспериментального устройства. Убавьте свет как можно слабее, до тех пор, пока личинки хорошо видны глазами. Выньте личинок из питательной среды ложкой, аккуратно выберите личинку третьего возраста и промойте ее дистиллированной водой. Будьте осторожны, промывайте личинку по одной, чтобы избежать помех от голода. Для одного эксперимента требуется не менее 20 личинок.
4. Перенесите личинку в центр агаровой пластины, расположенной под камерой на шаге 1.3. Аккуратно удалите лишнюю воду с личинки с помощью щетки или используйте промокательную бумагу, чтобы удалить воду с личинки, чтобы предотвратить отражение света под линзой. Выключите свет в комнате и дайте личинке акклиматизироваться в течение 2 минут в темноте.
5. Включите светодиодную лампу, чтобы получить инфракрасный свет, и аккуратно поднесите личинку к центру пластины. Когда личинка начнет ползать прямо, поверните пластину, чтобы личинка направилась в сторону светового пятна. Убедитесь, что он с самого начала ползает прямо, иначе он может не получить доступ к световому пятну.
6. Нажмите «Захват» | Настройка | Захват видео, чтобы выбрать путь сохранения, затем нажмите «Начать запись для записи». Позвольте личинке подползти к световому пятну, войдите в световое пятно, затем покиньте световое пятно, пока оно не исчезнет из поля зрения. Нажмите Остановить запись. Если личинка отворачивается от светового пятна до того, как приблизится, нажмите кнопку Остановить запись.
7. Отодвиньте фильтр от камеры. Снимите короткое видео о положении светового пятна с именем "lightarea2" и сравните его с "lightarea1", чтобы убедиться, что положение светового пятна не изменилось. Если наблюдается явное изменение положения, отбросьте данные.

Результаты

Рисунок 1: Экспериментальная установка. (A) Схематическое изображение установки для быстрого фототаксиса на основе личинок на основе световых пятен. Синие линии представляют пути видимого света, используемого для визуальной стимуляции, а красные линии представляют пути инфракрасного света. Стрелки указывают направление света. Полосовой фильтр с длиной волны 850 нм пропускает инфракрасный свет, но блокиру...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
850 нм ± инфракрасный светодиод с длиной волны 3 нм	Thorlabs, США	ПМ100А	Совместимые датчики: фотодиодные и тепловые<бр /> Диапазон оптической мощностиa: от 100 пВт до 200 Вт<бр/> Доступный диапазон длин волн сенсораa: 185 нм-25 мкм Частота обновления дисплея: 20 Гц<бр/> Полоса пропускания: DC-100 кГц<бр/> Диапазон фотодиодных датчиковb: 50 нА-5 мА<бр/> Диапазон датчиков термобатареиb: 1 мВ-1 В
Преобразователь переменного тока в постоянный	Thorlabs, США	С120ВЦ	Размер диафрагмы: Ø9,5 мм Диапазон длин волн: 200-1100 нм<бр/> Диапазон мощности: 50 нВт-50 мВт<бр/> Тип детектора: кремниевый фотодиод (расширенный УФ) Линейность: ±0,5%<бр/> Погрешность измерения: ±3% (440-980 нм), ±5% (280-439 нм), ±7% (200-279 нм, 981-1100 нм)
Полосовой фильтр	Thorlabs, США	ДК2100	Диапазон тока светодиода: 0-2 А<бр /> Текущее разрешение светодиода: 1 мА<бр /> Точность тока светодиода: ±20 мА<бр/> Прямое напряжение светодиода: 24 В<бр/> Диапазон частот модуляции: 0-100 кГц синусоидальная волна Модуляция: произвольная
Коллимированный светодиодный синий свет	ELP, Китай	USBFHD01M	Максимальное разрешение: 1920x1080 F6,0 мм<бр /> Сенсор: 1/2,7" CMOS OV2710
Компактная консоль измерителя мощности	Ocean Optics, США	USB2000+(РАД)	Размеры: 89,1 мм x 63,3 мм x 34,4 мм<чел. /> Вес: 190 г<бр/> Детектор: Sony ILX511B (2048-элементная линейная кремниевая ПЗС-матрица) Диапазон длин волн: 200-850 нм<бр/> Время интеграции: 1 мс – 65 секунд (20 секунд типично)<чел/> Динамический диапазон: 8,5 x 10^7 (система); 1300:1 для одного приобретения Отношение сигнал/шум: 250:1 (полный сигнал) Темновой шум: 50 RMS отсчетов Решетка: 2 (250 – 800 нм)<бр/> Щель: SLIT-50 Линза для сбора детектора: L2 Сортировка заказов: OFLV-200-850 Оптическое разрешение: ~2,0 нм FWHM Рассеянный свет: <0,05% на длине волны 600 нм; <0,10% при 435 нм<бр/> Оптоволоконный разъем: SMA 905 на одножильное волокно с числовой апертурой 0,22
Мощный светодиодный драйвер	Минхунши, Китай	MHS-48XY	Рабочее напряжение: DC12V Центральная длина волны: 850 нм
веб-камера высокого разрешения	Thorlabs, США	МВВХЛ4	Цвет: теплый белый<бр /> Коррелированная цветовая температура: 3000 K Испытательный ток для типичной мощности светодиода: 1000 мА<бр/> Максимальный ток (CW): 1000 мА<бр/> Пропускная способность (FWHM): N/A Электрическая мощность: 3000 мВт<бр/> Угол обзора (полный угол): 120° Размер эмиттера: 1 мм x 1 мм<бр /> Типичный срок службы: > 50 000 ч<бр/> Рабочая температура (без конденсации): от 0 до 40 °C Температура хранения: от -40 до 70 °C Группа риска: RG1 – группа низкого риска
Светодиод теплый белый	Мега-9, Китай	БП850/22К	Ø25,4(+0~-0,1) мм<бр /> Пропускная способность: 22±3 нм<бр/> Пиковый коэффициент пропускания: 80%<бр/> Центральная длина волны: 850 нм±3 нм
спектрометр	Ноэль Данжу	Амкап9.22	AMCap — это приложение для фото- и видеосъемки с расширенными функциями предварительного просмотра и записи. Это настольное приложение, предназначенное для компьютеров под управлением Windows 7 SP1 или более поздней версии. Поддерживается большинство устройств, совместимых с Video-for-Windows и DirectShow, будь то дешевые веб-камеры или усовершенствованные карты видеозахвата.
Стандартный датчик мощности фотодиода	Супер Дракон, Китай	YGY-122000	Вход: переменный ток 100-240 В ~ 50/60 Гц 0,8 А<бр /> Выход: постоянный ток 12 В 2 А
Датчик тепловой мощности	Thorlabs, США	М470Л3-К1	Цвет: Синий<бр /> Номинальная длина волны: 470 нм<бр/> Полоса пропускания (FWHM): 25 нм<бр/> Максимальный ток (CW): 1000 мА<бр/> Прямое напряжение: 3,2 В<бр/> Электрическая мощность (макс.): 3200 мВт<бр/> Размер эмиттера: 1 мм x 1 мм<бр /> Типичный срок службы: 100 000 ч<бр/> Рабочая температура (без конденсации): от 0 до 40 °C Температура хранения: от -40 до 70 °C Группа рискаb: RG2 – группа умеренного риска
Датчик тепловой мощности	Thorlabs, США	С401С	Диапазон длин волн: 190 нм-20 мкм<бр/> Диапазон оптической мощности:10 мкВт-1 Вт (3 Вт)<бр/> Размер входной апертуры: Ø10 мм<бр/> Площадь активного извещателя: 10 мм x 10 мм Максимальная плотность оптической мощности: 500 Вт/см2 (средняя)<бр/> Линейность: ±0,5%