Вскрытие личиночных кольцевых желез: выделение эндокринных органов развития у дрозофил

Аннотация

Источник: Imura, E., et al. Протоколы визуализации стероидогенных органов и их интерактивных органов с иммуноокрашиванием у плодовой мушки Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (2017).

Это видео описывает кольцевую железу дрозофилы, сложную эндокринную структуру, важную для биосинтеза и секреции экдистероидов и других гормонов. Представленный протокол демонстрирует его вскрытие, фиксацию и иммуноокрашивание.

Протокол

Этот протокол представляет собой выдержку из Imura et al., Protocols for Visualizing Steroidogenic Organs and Their Interactive Organs with Immunostaining in the Fallen Fly Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2017).

ПРИМЕЧАНИЕ: Общая схема протоколов показана в Рисунок 1.

1. Вскрытие личиночного кольцевого железа (RG)

ПРИМЕЧАНИЕ: У D. melanogaster, который принадлежит к cyclorrhaphous Diptera, PG находится внутри составного эндокринного органа, называемого кольцевой железой (RG, Рисунок 2D). Поскольку хирургическое отделение ПГ от других типов клеток невозможно (обсуждается ниже), практической целью является выделение неповрежденного, неповрежденного РГ путем вскрытия.

1. Подготовка личинок на соответствующих стадиях развития
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы синхронизировать стадии развития личинок D. melanogaster, необходимо собирать яйца в узком временном окне и собирать личинки в соответствующее время.
   1. Собирать яйца в течение 2 ч на тарелке для агара с виноградным соком при температуре 25 °C.
   2. Соберите только что вылупившихся личинок^1-го возраста под препарирующим микроскопом с помощью щипцов и перенесите их в небольшой флакон, содержащий пюре из стандартного корма для мух из дрожжей и кукурузной муки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возраст личинок представлен как «часы после откладки яиц (hAEL)», «часы после вылупления (hAH)» или «часы после экдиза L3 (hAL3E)».
   3. В подходящий момент времени соберите ступенчатых личинок с помощью одноразовой пластиковой петли, чтобы избежать нежелательных травм. Чтобы свести к минимуму разницу в прогрессии развития личинок^3-го возраста, соберите личинки^2-го возраста при 70 hAEL (48 hAH) и дайте им линять с интервалом в 2 часа. Затем соберите личинки^3-го возраста в течение 2 ч после экдиза L3; эта процедура дает 0-2 личинки hAL3E.
   4. Перенесите выращенных личинок в чашку, наполненную фосфатно-солевым буфером (PBS).
   5. Промойте личинки PBS, чтобы удалить остатки пищи из организма.
2. Грубое препарирование личинок под препарирующим микроскопом
   1. Зажмите крючок для рта личинки щипцами. Разрежьте тело личинки на передней трети длины тела с помощью микроножниц.
   2. Придерживайте отрезанный конец переднего тела личинки одной парой щипцов. С помощью другой пары щипцов осторожно надавите кончиком головы на внутреннюю часть тела; Эта процедура выворачивает тело личинки наизнанку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап можно пропустить для вскрытия личинок^1-го возраста.
   3. Повторите шаги 1.2.1-1.2.2 с дополнительными личинками в течение 5-10 мин.<бр/> ПРИМЕЧАНИЕ: Количество личинок должно быть равно или меньше 20, чтобы сэкономить время на вскрытие.
3. Фиксация и окрашивание тканей с помощью иммуногистохимии
   1. Поместите переднюю треть тел личинок (шаг 1.2.2) в микропробирку объемом 1,5 мл, заполненную 500 мкл раствором фиксации (4% параформальдегида в PBS). Фиксируйте менее 20 образцов за один раз, в противном случае PBS, прикрепленный к зафиксированным образцам, может вызвать неблагоприятное разведение фиксатора. Для рассечения галтели удалите каплю PBS, а затем добавьте каплю раствора фиксации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для фиксации раствора можно использовать либо 3,7% формальдегида, либо 4% параформальдегида.
   2. Инкубируйте рассеченные ткани в растворе фиксации в течение 30 минут при комнатной температуре (RT) или в течение 2 часов при 4 °C.
   3. Замените раствор фиксатора на 500 мкл PBS и быстро промойте образцы 3 раза. Промойте образцы 500 μL 0,3% PBT (PBS + 0,3% октилфенолэтоксилат) в течение 15 минут на коромысле в режиме RT. Для вскрытия скругления удалите штифты от насекомых и перенесите образцы в микропробирку объемом 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения проницаемости антител в ткани образцы обрабатывают 500 мкл 2,0% PBT в течение 1-2 ч на коромысле в режиме ЛТ.
   4. Замените ПБТ на 500 мкл блокирующего раствора (2% бычьего сывороточного альбумина в ПБТ). Инкубируйте образцы в течение 1,5 ч на коромысле в режиме RT.
   5. Замените блокирующий раствор на 50 мкл первичного раствора антитела, т.е. антител, разведенных в блокирующем растворе.
   6. Инкубируйте образцы в течение ночи на коромысле при температуре 4 °C.
   7. Замените первичный раствор антитела на 500 мкл 0,3% ПБТ и быстро промойте образцы 5 раз. Промойте образцы 3 раза 500 μл 0,3% PBT в течение 15 минут каждый на коромысле в режиме RT.
   8. Замените 0,3% ПБТ на 50 мкл вторичного раствора антитела (конъюгированные с красителем антитела, разведенные в блокирующем растворе). Для ядерного окрашивания в раствор 50 мкл добавляют 0,5 мкл 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 0,1 мг/мл стокового раствора). Инкубируйте образцы на коромысле в течение 2 часов при RT или при 4 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните образцы в темноте.
   9. Замените раствор антитела на 500 мкл 0,3% PBT и промойте 5 раз. Промойте образцы 3 раза 500 μL 0,3% PBT в течение 15 минут каждый в режиме RT.
4. Тонкая диссекция комплекса мозг-РГ, содержащего ПГ и монтирование
   1. С помощью одноразовой пипетки перенесите иммуноокрашенные образцы в чашку, наполненную 0,3% PBT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать неприятных пузырей во время рассечения и монтажа, 0,3% PBT можно заменить на PBS.
   2. Под препарирующим микроскопом придерживайте кутикулу или крючок для рта одной парой щипцов. С помощью иглы 27 G, прикрепленной к шприцу объемом 1 мл в качестве «ножа», разрежьте передний кончик пищевода и глазные диски, чтобы удалить комплекс мозг-RG-глазной диск из кутикулы тела.
   3. Отделите пищевод и кишечник от комплекса мозг-RG-диск глаза с помощью щипцов. Поскольку пищевод проходит через мозг над вентральным нервным канатиком (ВНК), вытяните кишечник на заднюю сторону.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить лишние имагинальные диски из образцов, разрежьте соединения между мозгом, глазными дисками и дисками ног с помощью игольчатого ножа.
   4. Повторите шаги 1.4.1-1.4.4 для других образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы остатки тканей не прилипали к образцам, перенесите каждый готовый образец в другую чистую чашку, наполненную 0,3% PBT или PBS.
   5. Перенесите образцы в центр чистого предметного стекла с помощью микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для личинок^2-го или^3-го возраста конец наконечника микропипетки должен быть усечен лезвием бритвы.
   6. Под препарирующим микроскопом выровняйте отдельные образцы тыльной стороной вверх с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: РГ расположена на дорсальной стороне мозга (рисунок 2A). Такое выравнивание облегчает спецификацию отдельных образцов во время визуализации.
   7. Наклоните предметное стекло и сотрите как можно больше излишков ПБТ. Капните каплю монтажного реагента на боковую сторону предметного стекла. Поместите край покровного листика с другой стороны капли и медленно наденьте покровный лист на образцы с помощью щипцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура предотвращает смещение образцов за пределы защитного стекла.
   8. Храните образцы при температуре 4 °C. Храните образцы в темноте.

Результаты

Рисунок 1: Общая схема протоколов. К личинкам и взрослым самкам применимы два различных метода препарирования, в зависимости от цели экспериментов. Методы монтажа также разрабатываются в соответствии с условиями образца. Методы фиксации, окрашивания и визуализации в основном являются общими для всех образцов. Пожалуйста, нажмите здес...

Материалы

Список материалов, использованных в этой статье

Имя	Компания	Каталожный номер	Комментарии
Сбор яиц
чашка для культуры тканей (55 мм)	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	1-8549-02	для агаровых тарелок из виноградного сока
Чашка для сбора	ХИКАРИ КАГАКУ
дрожжевая паста	Восточные сухие дрожжи, Токио
100% виноградный сок	Уэлч Фуд Инк.
выращивание личинок
маленькие флаконы (12 мл, 40×23,5 мм, PS)	САРШТЕДТ	58.487
одноразовая петля	КАК ЕДИНОЕ ЦЕЛОЕ	Тел.: 6-488-01
Стандартный корм для мух			Рецепт есть на сайте стокового центра Блумингтона.
вскрытие
Препарирующий микроскоп	Карл Цейсс	STEMI 2000-C
Препарирующий микроскоп	Лейка	С8 АП0
Чашка для культивирования тканей (35 x 10 мм, необработанная)	ИВАКИ	1000-035
Сильгард	ТОРЕЙ		Обертывание силикона внутри посуды
Игла Terumo (27G, 0,40 x 19 мм)	ТЕРУМО	НН-2719С	«Нож» для разрезания ткани
щипцы, Inox, #5	Дюмон, Швейцария
булавка для насекомых (0,18 мм в диаметре)	Бренд Shiga		для рассечения скругления
микроножницы	НАЦУМЭ СЭЙСАКУСЁ КО ЛТД.	МБ-50-10
фиксация
Сверхчистая вода	Мерк Миллипор
фосфатный буферный раствор (PBS)
формальдегид	Накалай теске	16222-65
Параформальдегид	Накалай теске	02890-45
Тритон-Х100	Накалай теске	35501-15
микропробирки (1,5 мл)	INA OPTIKA	КФ-0150
инкубация
В качестве однополосного смесителя ТМ-300 (коромысло)	Как единое целое	ТМ-300	рокер
Бычий сывороточный альбумин	сигма	9048-46-8
Первичное антитело
анти-Сро (морская свинка), 1:1000
анти-GFP (кролик), 1:1000	Молекулярные зонды	А6455	Симада-Нива и Нива, 2014
анти-GFP (мышь mAb, GF200), 1:100	Накараи теске	04363-66
анти-5HT (кролик), 1:500	сигма	С5545
анти-Hts 1B1 (мышь)	Центр исследований развития Hybridoma Bank (DSHB)	1В1
анти-ДЭ-кадгерин (крыса), 1:20	ДШБ	DCAD2
anti-NC82 (мышь), 1:50	ДШБ	НС82
Вторичные антитела
Вторичное антитело козы против кролика IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 488	Технологии Life	А-11008
Козье вторичное антитело к мышиному IgG (H+L), конъюгат Alexa Fluor 488	Технологии Life	А-11001
Вторичное антитело IgG (H+L) против крыс, конъюгат Alexa Fluor 546	Технологии Life	А-11081
Вторичное антитело IgG (H+L) против морской свинки, конъюгат Alexa Fluor 555	Технологии Life	А-21435
Alexa Fluor 546 конъюгированный с красителем фаллоидин	Технологии Life	А-22283
Монтажные реагенты
Микрослайд-стекло	Мацунами Гласс Инд., Лтд.	СС7213
Квадратное покровное стекло микроскопа	Мацунами Гласс Инд., Лтд.	C218181
Реагент FluorSave (Монтажный реагент)	Кальбиохим	345789
Переводная пипетка 1 мл (Одноразовая пипетка)	Уотсон	5660-222-1С
Нахлыстовые приклады
ж; GMR45C06-GAL4			из Блумингтонского фондового центра дрозофилы. (#46260)
UAS–GFP; UAS–mCD8::GFP			подарки от К. Ито, Токийский университет.
Ш[1118]
w; phantom-GAL4#22/UAS-turboRFP
ж; UAS-mCD8::GFP; ТРХ-ГАЛ4			Ли, Х. Х. (2014) и Алексеенко, О. В., Ли, К. и Кравиц, Э. А. (2010)
ж; UAS-mCD8::GFP			из Блумингтонского фондового центра дрозофилы. (#32188)
yw;; nSyb-GAL4			из Блумингтонского фондового центра дрозофилы. (#51941)