Этот протокол является выдержкой из Chattopadhyay et al., Local and Global Methods of Assessment Thermal Nociception in Drosophila Larvae, J. Vis. Exp. (2012).
1. Локальный анализ теплового зонда
Мы доставляем вредный тепловой стимул к отдельному сегменту тела личинки с помощью специально изготовленного термозонда, изготовленного Pro-Dev Engineering (см. Таблицу материалов). Несмотря на то, что данный щуп обладает оптимальными конструктивными особенностями (небольшой металлический наконечник площадью ~,07мм2 и способность точно поддерживать заданную температуру от 23 °C до 65 °C), в принципе любого инструмента с небольшим наконечником, который можно нагревать до определенной температуры в течение периода до 20 секунд, должно хватить. Зондовый наконечник используется для стимуляции личинок раннего3-го возраста точно на дорсальной средней линии в брюшном сегменте A4 (см. Рисунок 1). В ответ на этот тепловой стимул личинки, как правило, демонстрируют отвратительное поведение при отталкивании при перекате в сторону на 360 градусов или более. Это поведение отличается от их легкой реакции на прикосновение к безвредному металлическому зонду комнатной температуры, которая обычно включает в себя короткую паузу в их двигательной активности.
Протокол для анализа теплового зонда:
- Заданная температура термозонда до желаемого заданного значения.
- С помощью кисти или щипцов аккуратно перенесите отдельную личинку на плоскую платформу (обычно мы используем небольшой кусочек винила, вырезанный из связующего), на котором впоследствии будут стимулироваться личинки. Личинка должна быть покрыта тонкой пленкой воды перед контактом с термозондом. Пленка воды, покрывающая личинку, должна быть как можно меньше и полностью покрывать личинку, следя при этом, чтобы личинка не была сухой при прикосновении к винилу.
- Осторожно прижмите наконечник зонда к личинке в точке сегмента A4, слегка надавливая кончиком под углом около 45° между зондом и поверхностью личинки (см. Рисунок 1). Давление должно вызывать небольшое углубление на поверхности личинки и, как правило, будет достаточным для предотвращения передвижения. Если личинка продолжает двигаться, приложите немного больше давления, и она, как правило, остановится. Не записывайте данные от личинок, которые выходят за пределы поля зрения или для которых постоянный контакт зонда не может быть достигнут до ответа или отсечки в 20 с.
- Продолжайте стимулировать личинку до тех пор, пока не проявится реакция отмены или пока не будет достигнут 20-секундный порог, в зависимости от того, что произойдет раньше. Реагирующие личинки обычно сначала демонстрируют предварительное поведение по поднятию головы и хвоста. За этим обычно следует отвод крена не менее чем на 360 градусов. Только полный разворот на 360 градусов оценивается как ноцифензивное поведение (предварительный подъем головы или хвоста — нет).
- Как только поведение вывода будет инициировано, освободите контакт с зондом и запишите задержку или время вывода средств. Если в течение 20 секунд не наблюдается никакого поведения вывода, то личинка не реагирует. Спасатели могут быть разделены на 2 категории. Если поведение вывода проявляется в течение 5 секунд, то личинка быстро реагирует. Если поведение вывода проявляется между 5-20 секундами, то личинка медленно реагирует (см. Рисунок 1 в Babcock et al., Curr. Biol. (2009)).
