Этот протокол представляет собой отрывок из Liu et al. Анализ температурного градиента для определения тепловых предпочтений личинок дрозофилы, J. Vis. Exp. (2018).
1. Настройка температурного градиента
- Подготовка однонаправленного градиента
- Чтобы создать влажную окружающую среду во время анализов, поместите два алюминиевых блока, соединенных двумя водяными банями, на влажные бумажные полотенца, разделенные 10 см (Рисунок 1A).
- Включите две водяные бани за ~2 часа до начала анализа, чтобы дать достаточно времени для выравнивания температуры алюминиевых блоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется провести имитационный эксперимент для определения температуры каждой водяной бани, которая необходима для достижения желаемого линейного градиента температуры. Некоторые типичные температурные пары для установки водяных бань приведены в таблице 1. Однако обратите внимание, что температура поверхности зависит от температуры окружающей среды. Длина трубки также влияет на температуру, так как в трубах происходит охлаждение. Длина трубки в нашей установке составляет 1,5 м.
- Разогрейте в микроволновой печи 100 мл 1% агарозы при высокой мощности в круглой бутылке объемом 500 мл с широким горлышком и налейте 25 мл/пробирную пластину на ровную столешницу. Подготовьте две пробные пластины, которые можно одновременно разместить на алюминиевых блоках (Рисунок 1A).
После того как - агароза застынет (10-20 мин), аккуратно потрите каждую поверхность агарозы стандартной кухонной губкой или меламиновой губкой, чтобы поверхность агарозы слегка огрубела, чтобы при распылении воды на агарозный гель создалась гладкая тонкая водная мембрана, и не образовывались капли воды.
- Полностью погрузите планшеты в емкость с дистиллированной водой до тех пор, пока анализ не будет готов к выполнению, чтобы предотвратить высыхание планшетов.
- Подготовка двунаправленного градиента (необязательно)
- Чтобы создать влажную окружающую среду во время анализов, поместите три алюминиевых блока на расстоянии 8 см друг от друга (Рисунок 1B) на влажные бумажные полотенца.
- Включите две водяные бани за ~2 часа до начала анализа, чтобы дать достаточно времени для выравнивания температуры алюминиевых блоков.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется провести имитационный эксперимент для определения температуры каждой водяной бани для двунаправленного градиента. Некоторые типичные температурные пары для установки водяных бань приведены в таблице 2. Однако обратите внимание, что температура поверхности зависит от температуры окружающей среды. Длина трубки также влияет на температуру, так как в трубах происходит охлаждение. Длина трубки в нашей установке составляет 1,5 м.
- Чтобы агароза не высыпалась из пластины, оберните края алюминиевой пластины маркировочной лентой, чтобы образовалась стенка высотой 10 мм (Рисунок 1B).
- Используя режим высокой мощности, разогрейте в микроволновой печи 200 мл 1% агарозы в круглой бутылке с широким горлышком объемом 500 мл и налейте 120 мл на пробирную пластину.
- После того, как агароза застынет (~30 мин), аккуратно потрите каждую поверхность агарозы стандартной кухонной губкой или меламиновой губкой, чтобы поверхность агарозы стала слегка грубой, чтобы при распылении воды на агарозный гель создавалась гладкая тонкая водная мембрана и не образовывались капли воды.
- Полностью погрузите пробирные пластины в емкость с дистиллированной водой до тех пор, пока анализ не будет готов к выполнению, чтобы предотвратить их высыхание.
- Настройка однонаправленного градиента
- Подготовьте реактивы и предметы на стенде рядом с аппаратом для градиентного анализа (см. Таблицу материалов).
- Чтобы обеспечить эффективную передачу температуры, заполните любые зазоры между алюминиевыми блоками и пробными пластинами путем распыления воды на границе между блоками и пластиной.
- Надев перчатки, достаньте пробирные пластины из емкости с водой. Если вода проникает между агарозным гелем и пластиной и вызывает образование неровностей на поверхности, удалите воду с помощью микропипетки P1000.
- Поместите пробные пластины на алюминиевые блоки так, чтобы разграничения, которые находятся на расстоянии 2 см от любого края, точно совпадали с краями алюминиевых блоков (Рисунок 1A,C).
- Распылите воду на поверхность пластины (достаточно тонкой водяной мембраны, покрывающей поверхность агарозы), чтобы предотвратить высыхание агарозного геля. Убедитесь, что водная мембрана непрерывна и на ней нет капель воды, так как личинки могут попасть в капли воды.
- Накройте градиентную систему картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 минут, чтобы температура стабилизировалась.
- Проверьте температуру поверхности в 12 точках на пластине (рисунок 1C). Проведите два измерения в каждой зоне, чтобы установить, существует ли вариабельность в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обоих местах находится в пределах ± 0,2 °C от желаемой температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменчивость в пределах зоны обычно возникает из-за того, что точные расстояния между двумя точками и краями алюминиевых блоков не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоках, чтобы убедиться, что границы, которые находятся на расстоянии 2 см от любого края, точно совпадают с краями алюминиевых блоков.
- Если измеренный температурный градиент отклоняется от желаемого градиента, увеличьте или уменьшите настройку температуры водяной бани и повторно проверьте температуру поверхности после стабилизации температуры водяной бани.
- Накройте градиентную систему картонной коробкой до начала пробы.
- Настройка двунаправленного градиента (необязательно)
- Подготовьте реактивы и предметы на стенде рядом с аппаратом для градиентного анализа (см. Таблицу материалов).
- Распылите воду на поверхности трех алюминиевых блоков, чтобы обеспечить эффективную передачу температуры от алюминиевых блоков к пробным пластинам, заполнив любые зазоры между поверхностями.
- Осторожно выньте пробные пластины из емкости с водой и поместите их на алюминиевые блоки. Если вода проникает между агарозным гелем и пластиной, что может привести к образованию неровностей на поверхности, удалите воду с помощью микропипетки P1000.
- Поместите пробную пластину на алюминиевые блоки так, чтобы средние линии первой и последней зон с любого края точно совпадали с краями двух боковых алюминиевых блоков (Рисунок 1B,D).
- Распылите воду на поверхность пластины (достаточно тонкой водяной мембраны, покрывающей поверхность агарозы), чтобы предотвратить высыхание агарозного геля. Убедитесь, что водная мембрана непрерывна и на ней нет капель воды, так как личинки могут попасть в капли воды.
- Накройте градиентную систему картонной коробкой, чтобы уменьшить испарение воды и помочь стабилизировать температуру поверхности геля. Подождите 5-10 минут, чтобы температура выровнялась.
- Проверьте температуру поверхности в двух точках вдоль средней линии каждой из 10 зон (Рисунок 1D). Проведите два измерения в каждой зоне, чтобы установить, существует ли вариабельность в пределах зоны. Убедитесь, что температура в обоих местах находится в пределах ± 0,2 °C от желаемой температуры.
ПРИМЕЧАНИЕ: Изменчивость в пределах зоны обычно возникает из-за того, что точные расстояния между двумя точками и краями алюминиевых блоков не идентичны. Отрегулируйте положение пластины на алюминиевых блоках, чтобы убедиться, что средние линии первой и последней зон, ближайших к каждой кромке, точно совпадают с краями двух боковых алюминиевых блоков.
- Если измеренный температурный градиент отклоняется от желаемого градиента, отрегулируйте настройку (настройки) температуры водяной бани и повторно проверьте температуру поверхности после стабилизации температуры водяной бани.
- Накройте блоки картонной коробкой до начала проведения пробы.
2. Анализ и расчет
- Снимите картонную коробку и проверьте температуру поверхности геля непосредственно перед переносом личинок на пластину. Сведите к минимуму время, в течение которого картонная коробка открыта, чтобы не нарушить температурное равновесие. Если поверхность сухая, распылите на нее небольшое количество воды.
- Распределите 150 ± 50 личинок вблизи центра каждой пластины (между зонами 3 и 4 из 6 зон) для однонаправленного градиента (зона выброса; Рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двунаправленного градиента распределите 200-400 личинок вдоль средней зоны каждой половины (Рисунок 1D).
- Накройте каждую пробную пластину крышкой для микропланшетов, чтобы личинки не выползли наружу. Накройте установку картонной коробкой, чтобы предотвратить попадание света, которое может повлиять на выбор личинок агарозного геля.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для двунаправленного градиента не нужно накрывать пластину крышкой, потому что пластина больше, а предпочтительная температура личинок находится в средней зоне. Следовательно, мало личинок скапливается по краям и имеет возможность выползти наружу.
- Дайте анализу продолжаться в течение 10-30 минут для однонаправленного градиента и в течение 15-35 минут для двунаправленного градиента, в зависимости от возраста личинок (табл. 3).
- Снимите картонную коробку и крышку микропланшета. Сфотографируйте пластины сверху с помощью цифрового фотоаппарата. Сделайте две фотографии каждой контрольной пластины, чтобы исследователь мог выбрать для анализа ту, которая имеет лучшую контрастность и яркость.
- Удалите все личинки из пробирных планшетов и из любого места за пределами планшетов с помощью аспирации.
- Тщательно промойте планшеты для анализа, пробирки и сетчатое фильтр дистиллированной водой. Повторно используйте пробные пластины, приготовленные в тот же день, если поверхность агарозы не повреждена.
- Рассчитайте процентное распределение личинок в каждой зоне.
- Откройте фотографическое изображение результатов анализа с помощью любого программного обеспечения, позволяющего наносить на изображение маркировку. Чтобы обозначить зоны пробирного анализа, проведите вертикальные линии через каждые 2 см на основе разграничения на пробирной пластине.
- Посчитайте количество личинок в каждой зоне и запишите цифры. Не стоит подсчитывать личинок в регионах 0,5 см от любой из стен. Гель более густой у стенок, и температура поверхности в этих областях не линейна.
- Для однонаправленного градиента рассчитайте процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в заданной 2-сантиметровой зоне)/ (общее количество личинок в 6 зонах) х 100.
- Для двунаправленного градиента рассчитайте процентное распределение в каждой зоне следующим образом:
(количество личинок в заданной 2-сантиметровой зоне)/ (общее количество личинок в 5 зонах с каждой стороны градиента) х 100.
