Этот протокол является выдержкой из Chiu et al., Ashaving Locomotor Activity to Study Circadian Rhythms and Sleep Parameters in Drosophila, J. Vis. Exp.(2010).
1. Загрузка мух в трубки активности и система мониторинга активности опорно-двигательного аппарата
- Прежде чем загружать мух в пробирки активности, включите инкубаторы, в которых будут размещаться мониторы активности. Отрегулируйте температуру с помощью органов управления инкубатором и установите режим освещения/темноты с помощью контроллера освещения системы DAM ИЛИ собственной системы управления освещением инкубатора в соответствии с желаемым экспериментальным дизайном. Время, необходимое для загрузки мушек в активные трубки, должно быть достаточным для стабилизации температуры.
- Обезболите мух углекислым газом.
- С помощью тонкой кисти аккуратно перенесите одну муху в пробирку для активности.
- Возьмите середину одного куска пряжи длиной около полудюйма тонкими щипцами и вставьте пряжу в непищевой конец пробирки, чтобы закрыть отверстие и предотвратить побег мухи во время эксперимента, в то же время позволяя потоку воздуха попасть в трубку. В качестве альтернативы для закрытия отверстия можно использовать пластиковые колпачки с маленькими отверстиями (Trikinetics, Inc.).
- Убедитесь, что трубки лежат на боку до тех пор, пока муха не проснутся, иначе существует риск того, что муха прилипнет к пище.
- Вставьте трубки в мониторы активности. В более новой, более компактной модели мониторов Trikinetics (Trikinetics DAM2 и DAM2-7) необходимо удерживать трубки на месте резиновыми лентами, чтобы гарантировать, что инфракрасный луч проходит через трубку в центральном положении.
- Поместите мониторы активности в инкубаторы и подключите их к системе сбора данных через телефонные провода. Проверьте с помощью программного обеспечения для сбора данных DAM System, чтобы убедиться, что все мониторы подключены должным образом и с каждого из них собираются данные. Монитор излучает инфракрасный луч света через центр каждой стеклянной трубки. Локомоторная активность мух записывается в виде необработанных двоичных данных, где «единица» записывается каждый раз, когда инфракрасный луч прерывается, или «ноль», при котором инфракрасный луч не прерывается.
2. План эксперимента для записи данных для определения циркадной периодичности и амплитуды
- Мух синхронизируют и увлекают, подвергая их воздействию нужного светового/темного (LD) и температурного режима в течение 2-5 полных дней. Наиболее часто используемым условием уноса является цикл свет/темнота продолжительностью 12 часов света / 12 часов темноты (12:12 LD) при 25 °C. Это общепринятое стандартное условие в основном основано на мысли о том, что дрозофилы произошли из афроэкваториальных районов. При изучении циркадных ритмов есть некоторая фразеология, с которой необходимо ознакомиться. В соответствии с этим протоколом время, когда в инкубаторе загорается свет, определяется как время 0 (ZT0), а все остальные значения времени относятся к этому значению (например, в цикле LD 12:12 ZT12 — это время, когда свет выключается). При стандартных условиях LD 12:12 дикий тип Drosophila melanogaster обычно демонстрирует два приступа активности; один из них сосредоточен вокруг ZT0, названный "утренним" пиком, а другой - вокруг ZT12, названный "вечерним" пиком (Рисунок 1A). Утренние и вечерние приступы контролируются эндогенными часами, но есть также реакции «испуга», которые представляют собой временные всплески активности в ответ на переходы света к темноте. Два дня захвата — это минимум, и его можно использовать, например, на больших экранах, которые занимают больше времени и предназначены для измерения периодов свободного хода в постоянной темноте (см. ниже, шаг 2). Однако, если вас интересует изучение закономерностей активности во время ежедневного цикла «свет-темнота», предпочтительно поддерживать мух в течение 4-5 дней в LD, чтобы получить больше данных. По сути, увеличение числа мух или количества дней ЛД в окончательном анализе данных (например, совокупные данные за последние два дня локомоторной активности ЛД) позволит получить более надежные профили суточной активности и измерения (например, время утреннего или вечернего пика). Кроме того, ежедневное распределение активности изменяется в зависимости от продолжительности дня (фотопериода) и температуры. Основная причина изменения фотопериода или температуры по сравнению со стандартом заключается в том, что если кто-то хочет изучить, как модели ежедневной активности претерпевают сезонную адаптацию (например, Chen et al., Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). Дрозофилы также могут быть приучены к суточным температурным циклам (например, Glaser and Stanewsky, Curr Biol. (2005); Sehadova et al., Neuron (2009)). Температурные циклы, которые изменяются всего на 2-3 °C, достаточны для того, чтобы увлечь ритмы активности.
- Ритмы свободно бегущей двигательной активности измеряются в условиях постоянной темноты и температуры после окончания периода увлечения (см. выше, шаг 1). Настройка светового цикла может быть изменена в любое время в темной фазе в последний день ДД таким образом, чтобы следующий день эксперимента представлял собой первый день ДД. Семи дней сбора данных ДД достаточно для расчета циркадного периода и амплитуды (например, мощности или силы ритма) мух. В целом, размер выборки не менее 16 мух необходим для получения надежных периодов свободного хода для конкретного генотипа. Даже если вас интересует только измерение суточной активности, все равно лучше всего измерять периоды свободного бега мух в ДД, поскольку изменения эндогенного периода могут изменить ежедневное распределение активности в ДД. Например, мухи с длительными эндогенными периодами обычно демонстрируют поздние вечерние пики LD (например, см. Рисунок 2).
- По завершении эксперимента необработанные двоичные данные, собранные с помощью программного обеспечения DAM System, загружаются на портативное устройство хранения данных, например, на USB-накопитель.
- Необработанные двоичные данные обрабатываются с помощью DAM Filescan102X (Trikinetics, Inc.) и суммируются в ячейки по 15 и 30 минут при анализе циркадных параметров или от 1 до 5 минут при анализе параметров сна/отдыха. В настоящее время пять непрерывных минут бездействия являются стандартным определением сна/отдыха у дрозофил (Hendricks et al., Neuron (2000); Ho and Sehgal, Methods Enzymol., (2005)).
- Существует множество различных способов анализа данных, собранных в системе DAM, но мы предоставим только те методы, которые обычно используются в нашей лаборатории. Microsoft Excel используется для присвоения генотипа различным группам выборки. Программное обеспечение FaasX (M. Boudinot and F. Rouyer, Centre National de la Recherche Scientifique, Gif-sur-Yvette Cedex, France) или Insomniac (программа на основе Matlab; Лесли Эшмор, Университет Питтсбурга, Пенсильвания) используются для изучения циркадных (например, период и мощность) или параметров сна/отдыха (например, процент сна, средняя продолжительность отдыха во время отдыха) соответственно.
