Этот протокол является выдержкой из de Vries and Clandinin, Optogenetic Stimulation of Escape Behavior in Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp.(2013).
1. Создание каналродопсина мух
- Cross UAS-ChR2 летает с выбранным вами драйвером Gal4, мы используем G105-Gal4, который выражается в нейронах Foma-1 в оптической доле.
- Чтобы исключить возможность визуальной реакции на стимуляцию синим светом, обе линии мухи находятся на фоне w+norpA.
- Конечный результат: w+norpA; G105-Gal4/UAS-ChR2 +
- После того, как взрослые мухи приблизятся, посадите выбранных самок на свежий корм, дополненный 10 μМ полностью транс-ретиналь (кофактор, необходимый для ChR2) и защищенный от света, за 3 дня до проведения поведенческого анализа.
2. Приготовьте 10 μM полностью транс-ретинальный улучшенный корм
- Растворите 100 мг полностью транс-ретиналя в 17,6 мл 95% этанола до получения 20 мМ ретиналя. Всегда держите транс-ретиналь защищенным от света лицом.
- Растопите стандартный корм из кукурузной муки в микроволновой печи и дайте остыть до теплого состояния.
- Смешайте 50 мкл 20 мМ полностью транс-ретиналь во флаконах по 10 мл корма для мух.
- Дайте флаконам остыть и хранить в защищенном от света месте.
3. Оборудование
- Наконечники для пипеток: Стандартные наконечники пипеток объемом 1 000 мкл разрезаются рядом с наконечником, создавая диаметр пор ~2,25 мм.
- Платформа (см. Рисунок 1).
- Основание Delrin, 17 см X 25 см, было сконструировано с резьбовыми отверстиями на каждом углу для установки соединителей шланга охлаждающей жидкости 1/4" NPT.
- Вертикальный держатель, изготовленный из делрина, крепится к центру основания. Габаритные размеры составляют 25 мм X 40 мм X 65 мм (ширина X глубина X высота). По всей длине держателя проходит канавка шириной 10 мм, а внизу находится винт с накатанной головкой. К верхней части держателя прикреплена платформа размером 25 мм X 40 мм X 10 мм с отверстием диаметром 3,5 мм, совмещенным с пазом в держателе.
- Светодиодные матрицы (см. Рисунок 1).
- Четыре рукава шланга охлаждающей жидкости длиной ~18 см прикреплены к основанию платформы с помощью соединительного соединителя шланга охлаждающей жидкости. Шланг охлаждающей жидкости используется только в качестве конструкционной опоры и не используется для охлаждения.
- Правильно расположенные канавки вырезаются в конечном элементе шланга охлаждающей жидкости каждого рычага, чтобы прикрепить радиатор к концу каждого рычага.
- Синий светодиод Rebel Tri-Stars крепится к каждому радиатору с помощью предварительно нарезанной термоклейкой ленты. К каждой звезде Tri-Star прикреплена трехлинзовая линза Carclo 18°
.
- Светодиодные Tri-Star подключаются к драйверам постоянного тока BuckPuck и источнику питания, как указано. Мы организовали нашу установку так, что каждый BuckPuck приводит в действие два Tri-Star в серии.
- Освещение всех четырех светодиодных Tri-Star на уровне 700 мА дало излучение 713 Вт/м2 на нашей платформе.
- Камера: Камера установлена на небольшом штативе и сфокусирована на верхней части платформы.
4. Поведенческий анализ
- Кратковременно обезболивают мух на льду.
- Поместите отдельных мушек в наконечники пипеток, с помощью ленты заклейте оба конца наконечника.
- После того, как мухи проснулись и начнут активно исследовать кончик пипетки, снимите ленту и поместите пипетку в паз в вертикальном держателе. Винт с накатанной головкой используется для фиксации наконечника пипетки на месте и для закрытия нижней части наконечника.
- Пока муха исследует кончик пипетки (обычно 30-60 секунд), начните съемку на камеру непосредственно перед тем, как муха выйдет из кончика на платформу.
- После того, как муха вылетела на платформу, подождите 1-2 секунды и включите синие светодиоды. Используйте таймер, чтобы вручную измерить время, пока муха не начнет полет.
