Этот протокол является выдержкой из книги Воглера и Окорра "Визуализация бьющегося сердца у дрозофилы", J. Vis. Exp. (2009).
1. Прежде чем начать
- Свежеприготовленный раствор искусственной гемолимфы (АГ), содержащий 108 мМ Na+, 5 мМ К+, 2 мМ Ca2+, 8 мМ MgCl2, 1 мМ2PO4, 4 мМ NaHCO3, 10 мМ сахарозы, 5 мМ трегалозы, 5 мМ HEPES (pH 7,1, все реагенты от Sigma Chemicals). Сахароза и трегалозу следует добавлять в АГ из охлажденных исходных растворов непосредственно перед использованием, чтобы предотвратить бактериальное загрязнение.
- Доведите АГ до комнатной температуры и насытьте раствор кислородом, барботируя воздухом в течение не менее 15 минут.
- Оттяните несколько тонких капилляров (например, стеклянные капилляры, 100 мкл, VWR), необходимых для удаления жира.
2. Полуинтактное сердце дрозофилы от взрослой мухи
- Взрослых мух дрозофилы обезболивают препаратом Fly Nap (Carolina Biological Supply Co.) в течение 2-5 минут. Необходимо соблюдать осторожность, чтобы не оставлять мух в Fly Nap для более длительного воздействия. Кратковременное воздействие холода также может быть использовано для обезболивания мух, но CO2 не рекомендуется, поскольку он оказывает более длительное воздействие на частоту сердечных сокращений и ритмичность.
- Обезболенных мух помещают тыльной стороной вниз в чашку Петри, покрытую тонким слоем вазелина. Гидрофобная кутикула в крыльях и теле обратимо «прилипает» к желе, но при необходимости муху можно переместить. Особенно важным это становится во время последующих манипуляций.
- Первоначальный разрез делается с помощью изогнутых пружинных ножниц (Roboz #5611). Лезвия ножниц размещаются под ногами и наклонены вниз к тыльной поверхности грудной клетки возле шеи. Голова, вентральный нервный канатик и ноги удаляются с помощью одного надреза. Затем препарат погружают в насыщенный кислородом искусственный раствор гемолимфы (АГ).
- С помощью пружинных ножниц задний кончик живота (состоящий из сегментов брюшной полости 7 и 8) удаляется одним разрезом. Это обеспечивает доступ для выполнения боковых разрезов по обоим краям живота и служит для разрыва связи между задней кишкой и кутикулой живота. Затем удаляется освобожденный лоскут вентральной кутикулы живота.
- На этапах 3 и 4 передние и задние соединения кишечника разрываются, поэтому органы брюшной полости теперь удерживаются на месте только трахеолами. Кишечник и другие органы брюшной полости обычно могут быть удалены как единое образование с помощью ювелирных щипцов (Roboz, #55) и легкого перетягивания. При удалении внутренних органов обнаруживается бьющаяся сердечная трубка, все еще прикрепленная к тыльной стороне кутикулы, окруженная жировыми телами.
- Жировые тела довольно непрозрачны в световом микроскопе, поэтому часто бывает необходимо удалить часть этого жира, чтобы четко видеть сердечную трубку. Это достигается с помощью методики липосакции с использованием тонко прорисованных стеклянных капилляров. Капилляры изготавливаются с помощью стандартного съемника пипеток (например, Sutter P-97 Pipette Puller), а затем вставляются в пластиковую трубку (Tygon, 1/16 дюйма), прикрепленную к источнику вакуума. Эта система используется для отсасывания излишков жира вокруг сердечной трубки. Сила всасывания пропорциональна диаметру наконечника, поэтому не следует использовать пипетки с наконечниками диаметром более 40 микрон. Необходимо проявлять крайнюю осторожность, чтобы не прикасаться к самому сердцу, а поскольку задняя часть сердца очень хрупкая, следует вообще избегать этой области.
- Сердечная трубка взрослой дрозофилы теперь обнажена и должна биться. При необходимости кутикулу и прикрепленное сердце можно переместить, аккуратно приподняв кутикулу из вазелина и осторожно утрамбовав ее обратно, опять же избегая любого контакта с сердечной тканью. На этом этапе раствор для купания препарата следует заменить на свежий АГЛ. Перед любыми манипуляциями этому препарату следует дать сбалансироваться в течение 20-30 минут с насыщением кислородом. Если препарат должен сохраняться дольше 60 минут, его следует перфузировать свежим АГЛ.
