$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Этот протокол является выдержкой из Gou et al., High Throughput Assay to Examine Egg-Laid Preferences of Individual Drosophila melanogaster, J. Vis. Exp. (2016).
1. Строительство камеры, сборка, настройка анализа
- Пусть механический цех построит акриловые камеры для яйцекладки (Рисунок 1A-D). Инженерные чертежи различных деталей были показаны на дополнительном рисунке 1-3. Изображения в высоком разрешении также можно найти здесь (http://www.rebeccayang.org/pdf/chamber%20design.pdf).
- Вставьте пластиковые листы в загрузочную (верхнюю) часть камеры, как показано на рисунке Рисунок 1C. Она служит поверхностью дна при погрузке мух в отдельные площадки для кладки яиц.
- Обезболите самок на подушечке CO2 и загрузите их по отдельности в каждую арену для откладывания яиц. Дайте мухам ~30 минут, чтобы восстановиться отCO2 и акклиматизироваться к новой среде.
- Подготовьте агарозные субстраты.
- Для удобства держите готовую бутылку из растопленной 1% агарозы на водяной бане при температуре 55 °C.
- Добавьте нужное количество раствора сахарозы (2 М) в коническую пробирку объемом 50 мл и смешайте его с соответствующим количеством агарозы. Например, чтобы приготовить субстрат из сахарозы 150 мМ, поместите в пробирку 750 мкл 2 М раствора сахарозы, а затем заполните пробирку агарозой до отметки 10 мл.
- Таким же образом приготовьте обычный субстрат, но вместо раствора сахарозы добавьте дистиллированную воду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Конечная концентрация агарозы в этом протоколе составляет чуть менее 1%. По нашему опыту, точная концентрация агарозы не имеет значения, если она контролируется в пределах ~0,9 - 1,1% и что два субстрата имеют одинаковую концентрацию агарозы.
- Возьмите субстрат (нижнюю) часть камеры и нанесите пипеткой 1 000 μл агарозного субстрата в каждую корыту, как показано на рисунке Рисунок 1D.
- Дайте агарозе застыть в течение ~30 минут.
- Как только агарозный субстрат и мухи будут готовы, соберите все три части камеры для яйцекладки, а затем достаньте пластиковые листы.
- Поместите камеры в инкубаторы для мух.
ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность экспериментов по откладыванию яиц может варьироваться в зависимости от экспериментальных потребностей. Обычно мы проводим эксперимент O/N (14 - 16 часов). Кроме того, не наблюдалось существенного влияния циркадного времени на предпочтения в отношении яйцекладки.
- Обезболивайте самок, вводя в камеруСО2. Разберите камеру, выбросьте обезболивающих мух в морг для мух (т.е. пустую банку из-под кофе, наполненную кукурузным маслом). Сфотографируйте результаты для ведения записей (см. Рисунок 2).
- Подсчитайте количество яиц вручную и рассчитайте индексы предпочтений для анализа. Рассчитайте индекс предпочтения следующим образом: (Na - Nb)/(Na + Nb), где Na и Nb представляют количество яиц на участке a и на участке b соответственно.
